características morfológicas y biológicas del biofilm de Staphylococcus aureus formado en presencia de Plasma

Introducción

Staphylococcus aureus es un coccus grampositivo que coloniza la mucosa nasal y la piel de individuos sanos.1 este organismo puede causar una amplia gama de enfermedades, desde infecciones de piel o tejidos blandos hasta enfermedades sistémicas y fatales.1-3 en particular, s resistente a la meticilina., aureus (MRSA) es un organismo peligroso debido a su resistencia a múltiples antibióticos y la capacidad de formación de biopelículas. Las infecciones del torrente sanguíneo derivadas del sitio de infección focal o del dispositivo son ejemplos de casos graves de enfermedades por SARM. La aparición de MRSA adquirida en la comunidad (CA-MRSA), además del MRSA adquirido en el hospital convencional (ha-MRSA), plantea un alto riesgo para los pacientes inmunocomprometidos y las personas sanas.

Es bien sabido que las bacterias formadoras de biopelículas pueden sobrevivir en presencia de altas concentraciones de agentes antimicrobianos.,4 las biopelículas bacterianas consisten en una variedad de componentes y sustancias tanto de las bacterias (polisacárido, peptidoglicano y ADN) como del huésped (restos celulares, productos de coagulación y ADN). La composición del Biofilm varía dependiendo del organismo causante y/o factores del huésped.

S. aureus posee un factor de virulencia específico llamado coagulasa, que juega un papel importante en la formación de biopelículas durante las infecciones por S. aureus., La coagulasa se une a la protrombina del huésped y forma complejos activos de estafilotrombina, que convierte el fibrinógeno monomérico soluble en fibrina insoluble autopolimerizante y activa una cascada de coagulación.5 este fenómeno ha sido utilizado en laboratorios de microbiología clínica como prueba de coagulasa para la identificación de especies de estafilococos. En los últimos años, algunos informes han sugerido que S. aureus utiliza la fibrina y el fibrinógeno reclutados por la coagulasa para formar el andamio de biofilm.6

informes anteriores demostraron mecanismos de resistencia a los antibióticos en bacterias formadoras de biopelículas., Incluso en condiciones libres de plasma, las bacterias formadoras de biopelículas exhiben una alta resistencia a una variedad de antibióticos. La barrera a la acumulación y penetración de antibióticos debido a la estructura del biofilm, además de la naturaleza tolerante y estática de las bacterias en los biofilms, son cruciales para la resistencia a los antibióticos en los organismos que forman biofilm. Sin embargo, el conocimiento sobre la resistencia comparativa a los antibióticos en biopelículas con o sin plasma es limitado.7,8

en este estudio, comparamos las características del biofilm de S. aureus formado en presencia o ausencia de plasma., El análisis se realizó en dos cepas de referencia que eran representantes de CA-MRSA y ha-MRSA, respectivamente. Se aplicó microscopía de reflexión confocal de optimización continua (COCRM)9 para observar las características morfológicas del biofilm. COCRM nos permitió observar continuamente el mismo biofilm sin añadir colorantes fluorescentes. Finalmente, se comparó la resistencia a los antibióticos en biopelículas de S. aureus formadas con condiciones libres de plasma y agregadas a plasma.,

materiales y métodos

cepas bacterianas y Condiciones de cultivo

en este estudio se utilizaron dos cepas de MRSA, ATCC BAA1556 (cepa FPR3757; clon USA300) y N315 (clon Nueva York / Japón).10,11 estas cepas se almacenaron en caldo Brain Heart Infusion (BHI) (Becton Dickinson) con glicerol al 20% a -80°C. Antes de su uso, las cepas se cultivaron durante la noche en agar BHI y luego se subculturaron durante 12 horas en caldo BHI a 35°C con agitación a 160 rpm en condiciones aeróbicas., Un mililitro del cultivo fue centrifugado a 9,000 × g , y los pellets bacterianos fueron suspendidos en caldo de soja Triptica (Becton Dickinson) conteniendo 0.25% de glucosa (TSBG). Este paso se repitió una vez más. Las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) de vancomicina, linezolid y rifampicina para ambas cepas fueron de 0,5, 1 y 0,008 µg/mL, respectivamente. Las CMI de daptomicina para BAA1556 y N315 fueron de 0,5 y 0,25 µg / mL, respectivamente. Los protocolos de patógenos fueron aprobados por el Comité de seguridad de la Universidad de Toho para patógenos (aprobación no. 17-55-58).,

la cuantificación de la formación de biopelículas en una placa de 96 pocillos utilizando el método de tinción violeta cristalina

el plasma de conejo (Eiken Chemical, Tokio, Japón) se disolvió en TSBG y luego se diluyó con TSBG. Las concentraciones plasmáticas finales se ajustaron al rango de 0-12, 5% (v/v). Los cultivos bacterianos durante la noche se diluyeron a un OD600 de 0,01 (106-107 UFC / mL) utilizando TSBG que contenía plasma. Se inocularon cien alícuotas de microlitros en pocillos individuales de una placa de poliestireno de fondo redondo de 96 pocillos y se incubaron a 35°C durante 6-18 horas., Después de la incubación, las biopelículas se cuantificaron siguiendo un método de tinción violeta cristalina previamente reportado, excepto por el uso de ácido acético al 33,3% en lugar de etanol.12

visualización de la estructura del biofilm en una placa a base de vidrio utilizando COCRM

los cultivos durante la noche se diluyeron a un OD600 de 0,01 utilizando TSBG o TSBG conteniendo 7,14% de plasma. Las alícuotas de dos mililitros se inocularon en platos a base de vidrio (IWAKI, Tokio, Japón) y se incubaron a 35°C durante 12 o 24 horas., Después de la incubación, las biopelículas formadas en la superficie del vidrio se lavaron con agua, y las estructuras de la biopelícula fueron visualizadas por COCRM utilizando un microscopio de barrido láser Carl Zeiss (LSM 710) equipado con una lente de objetivo apocromático en plan de apertura numérica de 63 × /1.40.9,13 Biofilms y las superficies de vidrio se iluminaron con láser de argón de 514 nm, y la luz reflejada se recogió a través de un filtro de paso de banda de 505-530 nm. Como divisor de haz, se utilizó un medio espejo NT 80/20. Las imágenes de COCRM se analizaron con el software Carl Zeiss (ZEN 2011).,

formación de Biofilm en un sistema de células de flujo

las células de flujo (IBI Scientific, Dubuque, IA) se irrigaron continuamente con medio fresco (TSBG o TSBG con plasma al 0,39%) utilizando una bomba peristáltica (Ismatec, Glattbrugg, Suiza).14 los cultivos bacterianos durante la noche se diluyeron a un OD600 de 0,01 utilizando TSBG. Luego se inyectaron cuatrocientas alícuotas de microlitros de cada una de las llaves de paso de tres vías conectadas a los extremos distales de las células de flujo y se cultivaron durante 1 hora a 35°C En la superficie de vidrio de las células de flujo sin flujo., Después de la confirmación de la adhesión inicial utilizando COCRM, cada medio fluyó a una velocidad de 0,2 mL / min. Las biopelículas fueron incubadas durante 24 horas a 35°C. La formación de biopelículas fue evaluada por COCRM cada 3 horas.

efectos de los cambios del medio en la formación de biopelículas en una placa de vidrio

establecimos un protocolo similar al modelo de celda de flujo utilizando placas de vidrio para analizar la actividad antimicrobiana contra la biopelícula plasmática, ya que la placa de vidrio es muy versátil para observar la formación de biopelículas plasmáticas. Los cultivos durante la noche fueron diluidos a un OD600 de 0.01 en TSBG o TSBG conteniendo 0.,78% plasma. Las alícuotas de dos mililitros se inocularon en platos a base de vidrio y se incubaron estáticamente a 35 ° C En condiciones aeróbicas durante 1 hora para permitir la adhesión inicial. Este paso permite observar la adhesión de bacterias a la superficie del vidrio mediante microscopía de reflexión confocal (CRM). Posteriormente, los medios de cultivo se actualizaron cada hora para mantener un suministro de plasma constante durante 6 horas en total. El medio con plasma se reemplazó cinco veces durante 6 horas (a 1, 2, 3, 4 y 5 horas)., Después de la incubación, las biopelículas formadas en la superficie del vidrio se lavaron con agua, y las estructuras del biofilm fueron visualizadas por COCRM.

visualización de la penetración y acumulación de antibióticos dentro del biofilm utilizando vancomicina y daptomicina marcadas con fluorescentes

Los cultivos nocturnos se diluyeron a una OD600 de 0,01 en TSBG o TSBG conteniendo 0,78% de plasma. Las alícuotas de dos mililitros se inocularon en platos a base de vidrio y se incubaron a 35°C. Durante 6 horas de incubación, los medios de cultivo se actualizaron cada hora., Después de eliminar las bacterias flotantes lavándolas dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se agregaron antibióticos marcados con fluorescentes (BODIPY-FL-vancomicina o BODIPY-FL-daptomicina) a los platos a base de vidrio. BODIPY-FL-vancomicina se compró a Invitrogen, mientras que BODIPY-FL-daptomicina se sintetizó a partir de BODIPY-FL NHS Ester (Invitrogen) y daptomicina por Toho University School of Pharmaceutical Sciences. Ambos antibióticos se disolvieron en dimetilsulfóxido y luego se diluyeron con PBS con una concentración de iones de calcio ajustada a 50 mg / L., La concentración final de BODIPY-FL-vancomicina añadida a las biopelículas fue de 2 µg/mL. La BODIPI-FL-daptomicina sintetizada mostró una intensidad de fluorescencia débil en comparación con la vancomicina, por lo que la concentración final se ajustó a 20 µg/mL. La permeabilidad de ambos antibióticos dentro de las estructuras del biofilm se monitoreó durante 60 minutos utilizando un microscopio de barrido láser Carl Zeiss (LSM 710). Las Biofilms se iluminaron con láser de argón de 488 nm, y la luz reflejada se detectó con una ganancia de 550., Asimismo, se iluminaron los tintes BODIPY-FL con láser de argón de 488 nm y se detectó la fluorescencia verde para vancomicina y daptomicina con una ganancia de 670 y 600, respectivamente. Las imágenes en serie se analizaron con un software Carl Zeiss (ZEN 2011).

Determinación cuantitativa del número bacteriano viable después de la exposición a antibióticos

los cultivos durante la noche se diluyeron a una OD600 de 0,01 utilizando TSBG o TSBG conteniendo 0,78% de plasma. Las alícuotas de dos mililitros se inocularon en placas de poliestireno de seis pocillos y se incubaron a 35 ° C., Durante 6 horas de incubación, el medio de cultivo se actualizó cada hora. Después de la eliminación de bacterias flotantes, los biofilms se lavaron dos veces con TSBG, y luego se trataron con antibióticos de 64 × MIC durante 12 horas a 35°C. estos antibióticos se disolvieron en TSBG con concentración de calcio ajustada a 50 mg/L. solo rifampicina se disolvió en metanol y luego se diluyó con TSBG que contenía 50 mg/L de Ca2+. La concentración final de metanol fue de 500 µL / mL. En este experimento, se utilizaron TSBG conteniendo 50 mg/L de Ca2+ y metanol como control del caldo., Las bacterias flotantes se eliminaron después del tratamiento, y las biopelículas se lavaron dos veces con solución salina. Se utilizaron dos mililitros de proteinasa K (0,1 mg/mL; Wako, Osaka, Japón) disueltos en PBS para aflojar las estructuras de biofilm. Las biopelículas tratadas con proteinasa K se pelaron con un raspador.15 las suspensiones de biofilm se colocaron suavemente a 37°C durante 30 minutos y luego se diluyeron con solución salina y se platearon sobre agar nutriente para contar el número de bacterias incrustadas en biofilm. Después del crecimiento a 35 ° C, se contaron las colonias.

LIVE/DEAD viabilidad bacteriana de ensayo

tinción de Viabilidad de S., se realizó biofilm aureus con o sin plasma después de tratamientos con diferentes agentes anti-MRSA. Los cultivos durante la noche se diluyeron a un OD600 de 0,01 en TSBG o TSBG que contenía 0,78% de plasma. A continuación, 200 µL de alícuotas fueron inoculadas en ocho cubreobjetos cámara (IWAKI) y se incubaron a 35°C. Los medios de comunicación se actualizan cada hora durante 6 horas. Después de la eliminación de bacterias flotantes, las biopelículas se lavaron dos veces con TSBG y luego se trataron con antibióticos de 64 × MIC durante 12 horas a 35°C. estos antibióticos se disolvieron en TSBG con concentración de Ca2+ ajustada a 50 mg/L., Rifampicina se disolvió en metanol y luego se diluyó con TSBG que contenía 50 mg/L. La concentración final de metanol fue de 500 µL / mL. En este experimento, se utilizaron TSBG conteniendo 50 mg/L de Ca2+ y metanol como control del caldo. Las bacterias flotantes se eliminaron después del tratamiento. La viabilidad bacteriana en el biofilm fue determinada por el kit de viabilidad de biofilm FilmTracer™ LIVE/DEAD® (sondas moleculares). Las células viables fueron teñidas con SYTO 9 (verde), mientras que las bacterias muertas fueron teñidas con yoduro de propidio (rojo)., Después del tratamiento, las bacterias suspendidas fueron removidas y teñidas con solución de tinción viva/muerta durante 20 minutos. Después de la tinción, el sobrenadante se retiró y se lavó dos veces con agua pura, y luego la actividad bactericida del agente antibacteriano se evaluó visualmente mediante un microscopio de escaneo láser confocal.

análisis estadístico

los resultados analizados utilizando GraphPad Prism 5.0 se presentan como valor medio ± desviación estándar. Los resultados fueron considerados estadísticamente significativos cuando el valor de p fue < 0,05., Los resultados de experimentos cuantitativos realizados en Figs. 1 y 6 fueron analizados por análisis de varianza (ANOVA) con test de Tukey.

formación de biopelícula de S. aureus en la condición de célula de flujo en presencia de plasma

el sistema de células de flujo, que representa una condición clínicamente relevante, se utilizó para observar el efecto del suministro continuo de plasma sobre la formación de biopelícula., Se compararon los puntos temporales tempranos de formación de biofilm en la célula de flujo en presencia o ausencia de plasma por COCRM (Fig. 3). Sin plasma, se observó la Unión de pocas bacterias después de 3 horas de incubación. Por el contrario, se observaron agregados de formación de biopelículas en presencia de plasma en ambas cepas de S. aureus. La estructura de este biofilm plasmático después de 3 horas en el sistema de células de flujo fue similar a la del biofilm plasmático en estado estático a las 12 horas (Fig. 2)., Sin embargo, en la condición de célula de flujo, el desprendimiento de la biopelícula plasmática agregada se observó en puntos de tiempo posteriores de incubación (no se muestran los datos).

penetración y acumulación de vancomicina en biofilm de S. aureus

las cepas BAA1556 y N315 fueron incubadas en medio TSBG en presencia o ausencia de plasma al 0,78%. El medio de cultivo se actualizaba cada hora durante 6 horas. En la condición de control, la estructura del biofilm con o sin plasma fue examinada por COCRM (Fig. 4-i). Luego, se añadió vancomicina verde marcada con fluorescencia al cultivo y se observó la biopelícula durante 1 hora adicional., La penetración y acumulación de vancomicina se compararon en presencia o ausencia de plasma mediante microscopía láser confocal. Como era de esperar, se observaron diferencias sorprendentes en las estructuras del biofilm entre las muestras con o sin plasma. La adición de vancomicina verde fluorescente enfatizó aún más las diferencias entre las biopelículas con o sin plasma. En el biofilm libre de plasma, se observó la distribución difusa de la fluorescencia verde en ambas cepas., En contraste, se observaron estructuras rugosas en la superficie, manchadas irregularmente con fluorescencia verde, en el biofilm crecido en presencia de plasma (Fig. 4-ii). En el biofilm de S. aureus en estado libre de plasma, se observó difusión y fluorescencia verde fuerte 5 minutos después de la administración de vancomicina, que se intensificó en momentos posteriores. En contraste, el biofilm plasmático exhibió diferentes características de tinción en ambas cepas de S. aureus., La fluorescencia verde se observó débilmente en el biofilm plasmático a los 5 minutos, y posteriormente la acumulación de fluorescencia verde aumentó gradualmente. Estos datos demuestran un retraso en la penetración y acumulación de vancomicina en el biofilm plasmático, en comparación con el biofilm libre de plasma (Fig. 4-iii).

evaluación de la acumulación de daptomicina en el biofilm de S. aureus a lo largo del tiempo

utilizamos daptomicina verde marcada con fluorescencia y examinamos la penetración y acumulación de daptomicina en los biofilms de S. aureus. Dado que la intensidad de fluorescencia de la daptomicina era más débil que la de la vancomicina, se utilizó una mayor concentración de daptomicina en el experimento., En el biofilm formado en ausencia de plasma, la fluorescencia verde fue visible de 10 a 20 minutos, y después de eso, la intensidad de fluorescencia aumentó de manera dependiente del tiempo para ambas cepas de S. aureus. Por el contrario, la fluorescencia verde era apenas detectable en el biofilm plasmático, incluso después de 60 minutos de incubación (Fig. 5). Estos datos sugieren que retrasó la penetración y acumulación de daptomicina en el biofilm plasmático, en comparación con el biofilm libre de plasma., Desafortunadamente, no pudimos comparar los datos entre vancomicina y daptomicina, debido a las diferencias en las intensidades de fluorescencia verde de los antibióticos.

Efecto de los antibióticos sobre las bacterias cantidad de biofilm formado con o sin plasma

se comparó la actividad bactericida de los antibióticos en el biofilm formado con o sin plasma. Antes del tratamiento, se recuperaron recuentos similares de células bacterianas de biopelículas plasmáticas y libres de plasma., Este resultado sugiere que la cantidad de formación de BF aumentó proporcionalmente al grado de acumulación de componentes extracelulares, incluyendo la proteína del factor de coagulación, pero independientemente del número de células bacterianas adheridas. Los antibióticos anti-MRSA vancomicina, daptomicina o linezolid, con rifampicina redujeron el número de bacterias en la biopelícula libre de plasma. Sin embargo, las biopelículas plasmáticas de ambas cepas de S. aureus fueron generalmente más resistentes a los antibióticos, incluso en combinación con rifampicina., Para la cepa BAA1556, ninguna condición indujo más de dos log de reducción en el número bacteriano, mientras que la cepa N315 mostró una reducción significativa en el número bacteriano en el biofilm plasmático en presencia de rifampicina, vancomicina con rifampicina y daptomicina con rifampicina (Fig. 6). Estos resultados sugieren que las biopelículas plasmáticas son más resistentes a la actividad bactericida de los antibióticos anti-MRSA examinados. También realizamos tinción de viabilidad para diferenciar células vivas y muertas en las muestras anteriores., Algunos resultados de tinción fueron consistentes con el número bacteriano, pero hubo varias discrepancias entre la tinción y los recuentos bacterianos (Fig. S1).

discusión

el método de COCRM fue, por primera vez, aplicado para la observación del biofilm de S. aureus, que mostró el rápido crecimiento de biofilms en presencia de plasma. También se observaron retrasos en la penetración o acumulación de antibióticos y resistencia a la actividad bactericida de los agentes anti-MRSA en las biopelículas plasmáticas., Estos resultados sugieren que el biofilm plasmático es sustancialmente diferente morfológica y biológicamente del biofilm libre de plasma.

como se muestra en la Fig. 1, la presencia del plasma aumentó la formación del biofilm en 6 horas en ambas cepas de S. aureus, incluso en una concentración tan baja como 0,09% plasma. En momentos posteriores, la formación de biofilm se mejoró para la cepa BAA1556 en presencia de 3,12% o más de plasma, pero no para la cepa N315. Por el contrario, se observó una tendencia a la reducción de la masa del biofilm para la cepa N315 en concentraciones plasmáticas más altas., Dado que el método de tinción violeta cristalina evalúa la fijación del biofilm a los pocillos de microplacas, es probable que el desprendimiento del biofilm y la nueva formación del biofilm puedan reflejar la masa total del biofilm. Por lo tanto, observamos la dispersión o desprendimiento de biofilm en el sistema de células de flujo y a través de la incubación estática, especialmente en concentraciones más altas de plasma en puntos de incubación posteriores (datos no mostrados).,

en el sistema de células de flujo observado por COCRM, se observó biofilm agregado dentro de las 3 horas de incubación, lo que fue similar a 12 horas de incubación de biofilm plasmático en la condición estática. Un suministro continuo de plasma probablemente imite más de cerca el entorno in vivo, lo que podría acelerar la formación de biopelículas en el sistema de células de flujo. COCRM es una técnica de nuevo desarrollado13, que nos permitió observar el curso del tiempo de maduración y desprendimiento de biofilms sin utilizar colorantes fluorescentes., Por lo tanto, COCRM podría ser utilizado como una poderosa herramienta para analizar el mecanismo de formación de biopelículas y para evaluar posibles estrategias terapéuticas en la investigación de biopelículas.

Se observaron diferencias significativas entre la acumulación de vancomicina y daptomicina entre el plasma y el biofilm libre de plasma. Jefferson et al. informó que mientras que la vancomicina se une a las bacterias flotantes libres en el agua en 5 minutos, tomó más de 1 hora para unirse a las células dentro de las capas más profundas de un biofilm libre de plasma.,16 en experimentos de biopelícula libre de plasma, a concentraciones terapéuticas de vancomicina, la matriz de biopelícula no fue un obstáculo para la difusión de vancomicina.17 Sin embargo, cuando se utilizaron pocillos recubiertos con plasma humano, se observó un aumento de la susceptibilidad al fármaco de forma transitoria en la fase inicial (≤24 horas), mientras que las biopelículas más antiguas y densas exhibieron un alto nivel de resistencia en momentos posteriores (>48 horas).6 Cardile et al. demostró que la exposición de S., aureus al plasma produjo un aumento significativo de los componentes de la superficie microbiana, y las biopelículas aumentadas en plasma mostraron una mayor tolerancia a la vancomicina en comparación con las biopelículas cultivadas en medios libres de plasma.7 Además, en el modelo murino de infecciones de injertos vasculares protésicos, la daptomicina fue ineficaz en la erradicación de biopelículas, ya que la matriz actuó como escudo para la difusión de antibióticos.18 estos resultados sugieren que S., la resistencia o tolerancia a agentes anti-MRSA relacionada con el biofilm de aureus podría estar relacionada con múltiples factores, como la presencia de plasma, el tiempo de incubación, el cambio en la estructura de la superficie bacteriana y las diferencias de deformación.

se observó una reducción de la actividad bactericida con los antibióticos anti-MRSA en el biofilm plasmático, en comparación con el biofilm libre de plasma en ambas cepas. Aunque la cantidad de formación de biopelículas aumentó en presencia de plasma, el número de bacterias no aumentó., Se cree que el aumento en la formación de biofilm obtenido utilizando componentes plasmáticos interfiere con la actividad del agente antimicrobiano. En la cepa N315, la adición de rifampicina aumentó la actividad bactericida de vancomicina y daptomicina, pero su efecto fue pobre con la cepa BAA1556. Aunque el presente estudio examinó dos cepas diferentes, CA-MRSA (BAA1556) y ha-MRSA (N315), es necesario examinar más cepas para comprender mejor las diferencias de cepas y los mecanismos de resistencia e identificar combinaciones terapéuticas eficaces para la biopelícula plasmática.,

en este estudio, utilizamos plasma de conejo para analizar biofilm plasmático. Sin embargo, el plasma humano se debe utilizar para aclarar el comportamiento real del biofilm del plasma en el cuerpo humano. Además, el plasma se utilizó en baja concentración (0,39 − 7,14%) porque el plasma de alta concentración causa la coagulación del medio por la coagulasa del SARM, lo que dificulta la evaluación de la biopelícula plasmática. Sin embargo, se confirmó un aumento significativo en la cantidad de formación de biopelículas en estas Condiciones de proteína del factor de coagulación reducida, en comparación con la sangre., Un sistema de coagulación podría activarse in vivo, y por lo tanto se requieren más estudios para investigar las condiciones más cercanas al cuerpo humano en el futuro.

en conclusión, hemos reportado los efectos del plasma en la formación de biopelículas de CA-MRSA y ha-MRSA. Los datos muestran que el plasma es un factor crucial para determinar no solo la masa del biofilm en sí, sino también la naturaleza biológica del biofilm, incluida la sensibilidad a la penetración o acumulación de antibióticos y la resistencia a los medicamentos anti-MRSA., Estos resultados enfatizan aún más la importancia de las biopelículas plasmáticas para comprender los obstáculos asociados con la erradicación y el tratamiento en entornos de cabecera. Las biopelículas plasmáticas formadas en el modelo de células de flujo podrían representar una condición experimental clínicamente relevante, y la aplicación de COCRM facilita el análisis adicional de los mecanismos de formación de biopelículas y permite la detección de estrategias novedosas para combatir las infecciones por SARM.

Declaración de divulgación

No existen intereses financieros en competencia.

material suplementario

figura suplementaria S1