caractéristiques morphologiques et biologiques du Biofilm de Staphylococcus aureus formé en présence de Plasma

Introduction

Staphylococcus aureus est un coccus gram positif qui colonise la muqueuse nasale et la peau des individus en bonne santé.1 Cet organisme peut causer un large éventail de maladies allant des infections de la peau ou des tissus mous aux maladies systémiques et mortelles.1-3 en particulier, résistant à la méthicilline S., aureus (SARM) est un organisme dangereux en raison de sa résistance aux antibiotiques multiples et de sa capacité de formation de biofilm. Les infections de la circulation sanguine dérivées de l’appareil ou du site d’infection focale sont des exemples de cas graves de maladies à SARM. L’apparition du SARM acquis dans la communauté (SARM-CA), en plus du SARM acquis dans l’hôpital classique (SARM-HA), présente un risque élevé pour les patients immunodéprimés et les personnes en bonne santé.

Il est bien connu que les bactéries formant des biofilms peuvent survivre en présence de fortes concentrations d’agents antimicrobiens.,4 les biofilms bactériens sont constitués d’une variété de composants et de substances provenant à la fois des bactéries (polysaccharide, peptidoglycane et ADN) et de l’hôte (débris cellulaires, produits de coagulation et ADN). La composition du Biofilm varie en fonction de l’organisme responsable et/ou des facteurs de l’hôte.

S. aureus possède un facteur de virulence spécifique appelé coagulase, qui joue un rôle important dans la formation de biofilm lors d’infections à S. aureus., La Coagulase se lie à la prothrombine hôte et forme des complexes de staphylothrombine actifs, qui convertissent le fibrinogène monomère soluble en fibrine insoluble auto-polymérisante et activent une cascade de coagulation.5 ce phénomène a été utilisé dans les laboratoires de microbiologie clinique comme test de coagulase pour l’identification des espèces de staphylocoques. Ces dernières années, certains rapports ont suggéré que S. aureus utilise la fibrine et le fibrinogène recrutés par la coagulase pour former l’échafaudage du biofilm.6

des rapports antérieurs ont démontré des mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries formant des biofilms., Même dans des conditions sans plasma, les bactéries formant des biofilms présentent une résistance élevée à une variété d’antibiotiques. La barrière à l’accumulation et à la pénétration d’antibiotiques due à la structure du biofilm, en plus de la nature tolérante et statique des bactéries dans les biofilms, est cruciale pour la résistance aux antibiotiques dans les organismes formant des biofilms. Cependant, les connaissances sur la résistance comparative aux antibiotiques dans les biofilms avec ou sans plasma sont limitées.7,8

dans cette étude, nous avons comparé les caractéristiques du biofilm de S. aureus formé en présence ou en absence de plasma., L’analyse a été faite sur deux souches de référence qui étaient représentatives du SARM-CA et du SARM-HA, respectivement. Nous avons appliqué la microscopie à réflexion confocale à optimisation continue (COCRM)9 pour observer les caractéristiques morphologiques du biofilm. COCRM nous a permis d’observer en continu le même biofilm sans ajouter de colorants fluorescents. Enfin, la résistance aux antibiotiques a été comparée dans des biofilms de S. aureus formés avec des conditions sans plasma et avec plasma ajouté.,

matériaux et méthodes

souches bactériennes et conditions de culture

deux souches de SARM, ATCC BAA1556 (souche FPR3757; clone USA300) et N315 (clone New York / Japon), ont été utilisées dans cette étude.10,11 ces souches ont été stockées dans un bouillon Brain Heart Infusion (bhi) (Becton Dickinson) avec 20% de glycérol à -80°C. avant utilisation, les souches ont été cultivées pendant une nuit sur gélose BHI, puis sous-cultivées pendant 12 heures dans un bouillon BHI à 35°C avec agitation à 160 tr / min dans des conditions aérobies., Un millilitre de la culture a été centrifugé à 9 000 × g, et les pastilles bactériennes ont été mises en suspension dans un bouillon de soja tryptique (Becton Dickinson) contenant 0,25% de glucose (TSBG). Cette étape a été répétée une fois de plus. Les concentrations minimales inhibitrices (Cmi) de vancomycine, de linézolide et de rifampicine pour les deux souches étaient respectivement de 0,5, 1 et 0,008 µg/mL. Les CMI de la daptomycine pour BAA1556 et N315 étaient respectivement de 0,5 et 0,25 µg/mL. Les protocoles sur les agents pathogènes ont été approuvés par le Comité de sécurité des agents pathogènes de L’Université Toho (approbation no 17-55-58).,

Quantification de la formation de biofilm dans une plaque de 96 puits à l’aide d’une méthode de coloration au violet cristallin

le plasma de lapin (Eiken Chemical, Tokyo, Japon) a été dissous dans le TSBG puis dilué avec le TSBG. Les concentrations plasmatiques finales ont été ajustées de 0 à 12,5% (v/v). Des cultures bactériennes pendant la nuit ont été diluées à une OD600 de 0,01 (106-107 UFC / mL) en utilisant du plasma contenant du TSBG. Cent aliquotes de microlitre ont ensuite été inoculées dans des puits individuels d’une plaque de polystyrène à fond rond de 96 puits et incubées à 35°C pendant 6 à 18 heures., Après incubation, les biofilms ont été quantifiés selon une méthode de coloration au violet cristallin rapportée précédemment, à l’exception de l’utilisation d’acide acétique à 33,3% au lieu d’éthanol.12

visualisation de la structure du biofilm dans une cuve à base de verre à L’aide de COCRM

Les cultures de nuit ont été diluées à une OD600 de 0,01 à l’aide de TSBG ou de TSBG contenant 7,14% de plasma. Des aliquotes de deux millilitres ont été inoculées dans des plats à base de verre (IWAKI, Tokyo, Japon) et incubées à 35°C pendant 12 ou 24 heures., Après incubation, les biofilms formés à la surface du verre ont été lavés à l’eau et les structures du biofilm ont été visualisées par COCRM à l’aide d’un Microscope à Balayage Laser Carl Zeiss (LSM 710) équipé d’un objectif apochromatique à plan d’ouverture numérique de 63 × /1,40.9,13 Biofilms et les surfaces en verre ont été éclairés avec un Laser argon 514 nm, et la lumière réfléchie a été collectée à travers un filtre passe-bande 505-530 nm. Comme séparateur de faisceau, un demi-miroir NT 80/20 a été utilisé. Les images COCRM ont été analysées avec le logiciel Carl Zeiss (ZEN 2011).,

formation de Biofilm dans un système de cellules d’écoulement

Les cellules D’écoulement (IBI Scientific, Dubuque, IA) ont été irriguées en continu avec un milieu frais (TSBG ou TSBG contenant 0,39% de plasma) à l’aide d’une pompe péristaltique (Ismatec, Glattbrugg, Suisse).14 les cultures bactériennes de nuit ont été diluées à une OD600 de 0,01 à L’aide de TSBG. Quatre cents aliquotes de microlitre ont ensuite été injectées à partir de chacun des bouchons à trois voies reliés aux extrémités distales des cellules d’écoulement et cultivées pendant 1 heure à 35°C sur la surface vitrée des cellules d’écoulement sans écoulement., Après confirmation de l’adhésion initiale à L’aide de COCRM, chaque milieu coulait à raison de 0,2 mL / min. Les Biofilms ont été incubés pendant 24 heures à 35°C. La formation de biofilms a été évaluée par COCRM toutes les 3 heures.

effets des changements de milieu sur la formation de biofilm dans une cuve à base de verre

Nous avons établi un protocole similaire au modèle de cellule d’écoulement en utilisant des cuve en verre pour analyser l’activité antimicrobienne contre le biofilm plasmatique, car la cuve en verre est très polyvalente pour observer la formation de biofilm plasmatique. Les cultures pendant la nuit ont été diluées à une OD600 de 0,01 dans du TSBG ou du tsbg contenant 0.,78% de plasma. Des aliquotes de deux millilitre ont été inoculées dans des plats à base de verre et incubées statiquement à 35°C dans des conditions aérobies pendant 1 heure pour permettre l’adhésion initiale. Cette étape permet d’observer l’adhérence des bactéries à la surface du verre par microscopie à réflexion confocale (CRM). Par la suite, les milieux de culture ont été rafraîchis toutes les heures pour maintenir un apport constant de plasma pendant 6 heures au total. Le milieu avec du plasma a été remplacé cinq fois pendant 6 heures (à 1, 2, 3, 4 et 5 heures)., Après incubation, les biofilms formés à la surface du verre ont été lavés à l’eau et les structures du biofilm ont été visualisées par COCRM.

visualisation de la pénétration et de l’accumulation d’antibiotiques à l’intérieur du biofilm à l’aide de vancomycine et de daptomycine marquées par fluorescence

des cultures pendant la nuit ont été diluées à une OD600 de 0,01 dans du TSBG ou du TSBG contenant 0,78% de plasma. Des aliquotes de deux millilitre ont été inoculées dans des plats à base de verre et incubées à 35°C. Pendant 6 heures d’incubation, les milieux de culture ont été rafraîchis toutes les heures., Après avoir éliminé les bactéries flottantes en les lavant deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), des antibiotiques fluorescents (BODIPY-FL-vancomycine ou BODIPY-FL-daptomycine) ont été ajoutés aux plats à base de verre. BODIPY-FL-vancomycin a été acheté à partir D’Invitrogen, tandis que BODIPY-FL-daptomycin a été synthétisé à partir de BODIPY-FL NHS Ester (Invitrogen) et daptomycin par la Toho University School of Pharmaceutical Sciences. Les deux antibiotiques ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde, puis dilués avec du PBS dont la concentration en ions calcium a été ajustée à 50 mg/L., La concentration finale de BODIPY-FL-vancomycine ajoutée aux biofilms était de 2 µg / mL. La BODIPY-FL-daptomycine synthétisée a montré une faible intensité de fluorescence par rapport à la vancomycine, et par conséquent la concentration finale a été ajustée à 20 µg/mL. La perméabilité des deux antibiotiques à l’intérieur des structures du biofilm a été surveillée pendant 60 minutes à l’aide d’un Microscope à Balayage Laser Carl Zeiss (LSM 710). Les Biofilms ont été éclairés avec un Laser argon De 488 nm et la lumière réfléchie a été détectée avec un gain de 550., De même, les colorants BODIPY-FL ont été éclairés avec un Laser argon à 488 nm, et la fluorescence verte a été détectée pour la vancomycine et la daptomycine avec un gain de 670 et 600, respectivement. Les images en série ont été analysées avec un logiciel Carl Zeiss (ZEN 2011).

détermination Quantitative du nombre bactérien viable après exposition aux antibiotiques

Les cultures pendant la nuit ont été diluées à une OD600 de 0,01 en utilisant du TSBG ou du TSBG contenant 0,78% de plasma. Des aliquotes de deux millilitre ont été inoculées dans des plaques de polystyrène à six puits et incubées à 35°C., Pendant 6 heures d’incubation, le milieu de culture a été rafraîchi toutes les heures. Après l’élimination des bactéries flottantes, les biofilms ont été lavés deux fois avec du TSBG, puis traités avec 64 × MIC d’antibiotiques pendant 12 heures à 35°C. ces antibiotiques ont été dissous dans du TSBG avec une concentration de calcium ajustée à 50 mg/L. seule la rifampicine a été dissoute dans du méthanol, puis diluée avec du TSBG contenant 50 mg/L de Ca2+. La concentration finale de méthanol était de 500 µL / mL. Dans cette expérience, du TSBG contenant 50 mg/L de Ca2+ et du méthanol ont été utilisés comme bouillon témoin., Les bactéries flottantes ont été éliminées après le traitement et les biofilms ont été lavés deux fois avec une solution saline. Deux millilitres de protéinase K (0,1 mg/mL; WAKO, Osaka, Japon) dissous dans le PBS ont été utilisés pour desserrer les structures du biofilm. Les biofilms traités à la protéinase K ont été décollés à l’aide d’un grattoir.15 les suspensions de biofilm ont été délicatement placées à 37°C pendant 30 minutes, puis diluées avec une solution saline et plaquées sur une gélose nutritive pour compter le nombre de bactéries incorporées dans le biofilm. Après une croissance à 35°C, les colonies ont été comptées.

analyse de viabilité bactérienne vivante/morte

coloration de viabilité de S., le biofilm d’aureus avec ou sans plasma après des traitements avec différents agents anti-SARM a été réalisé. Les cultures pendant la nuit ont été diluées à une OD600 de 0,01 dans du TSBG ou du TSBG contenant 0,78% de plasma. Ensuite, des aliquotes de 200 µL ont été inoculées dans une chambre à huit puits (IWAKI) et incubées à 35°C. les milieux ont été rafraîchis toutes les heures pendant 6 heures. Après l’élimination des bactéries flottantes, les biofilms ont été lavés deux fois avec du TSBG, puis traités avec 64 × MIC d’antibiotiques pendant 12 heures à 35°C. ces antibiotiques ont été dissous dans le TSBG avec une concentration de Ca2+ ajustée à 50 mg/L., La rifampicine a été dissoute dans du méthanol, puis diluée avec du TSBG contenant 50 mg/l. La concentration finale de méthanol était de 500 µL/mL. Dans cette expérience, du TSBG contenant 50 mg/L de Ca2+ et du méthanol ont été utilisés comme bouillon témoin. Les bactéries flottantes ont été éliminées après le traitement. La viabilité bactérienne dans le biofilm a été déterminée par le kit de viabilité du Biofilm FilmTracer™ LIVE/DEAD® (Molecular Probes). Les cellules viables ont été colorées avec du SYTO 9 (vert), tandis que les bactéries mortes ont été colorées avec de l’iodure de propidium (rouge)., Après le traitement, les bactéries en suspension ont été enlevées et colorées avec une solution de coloration vivante/morte pendant 20 minutes. Après la coloration, le surnageant a été retiré et lavé deux fois avec de l’eau pure, puis l’activité bactéricide de l’agent antibactérien a été évaluée visuellement par un microscope à balayage laser confocal.

analyse statistique

les résultats analysés à L’aide de GraphPad Prism 5.0 sont présentés sous forme de valeur moyenne ± écart-type. Les résultats ont été considérés comme statistiquement significatifs lorsque la valeur p était < 0,05., Les résultats des expériences quantitatives effectuées dans les Figues. 1 et 6 ont été analysés par analyse de variance (ANOVA) avec un test de Tukey.

Résultats

Effets de plasma sur la formation de biofilm de S. aureus

Nous avons examiné la formation de biofilm dans diverses concentrations de plasma pour les deux souches de S., aureus, BAA1556 et N315. Dans les deux souches, la présence de plasma même à de faibles concentrations (0,09%) A induit une augmentation de la formation de biofilm après 6 heures d’incubation (Fig. 1). Dans la souche BAA1556, une augmentation de la formation de biofilm dépendante de la concentration a été observée à partir de 3,12% de plasma, et une croissance substantielle a été observée à 12 et 18 heures. Dans la souche N315, la formation de biofilm a été multipliée par Plus de trois de 6 à 12 heures en l’absence de plasma, sans différence entre 0% et 0,09% de plasma à 12 heures., Au contraire, une tendance à la réduction progressive de la masse du biofilm dépendante de la concentration a été observée dans la souche N315, à partir de 0,78% ou plus de concentration plasmatique.

caractéristiques morphologiques du biofilm de S. aureus en présence de plasma

le biofilm de S. aureus s’est formé lors d’une incubation statique en présence ou en absence de plasma, et la microstructure du biofilm a été comparée par COCRM. Comme indiqué dans la Fig. 2, un biofilm uniforme et plat a été formé en l’absence de plasma dans les souches BAA1556 et N315., En revanche, des biofilms inégaux et structurés en agrégats ont été observés en présence de plasma dans les deux souches. La morphologie microscopique du biofilm de S. aureus formé en présence de plasma était nettement différente de ceux formés sans plasma, et par conséquent, ceux-ci sont ci-après appelés biofilm de plasma.

formation de biofilm de S. aureus dans l’état de cellules d’écoulement en présence de plasma

le système de cellules d’écoulement, qui représente une condition cliniquement pertinente, a été utilisé pour observer l’effet de l’apport continu de plasma sur la formation de biofilm., Nous avons comparé les premiers temps de formation de biofilm dans la cellule d’écoulement en présence ou en absence de plasma par COCRM (Fig. 3). Sans plasma, la fixation de quelques bactéries a été observée après 3 heures d’incubation. En revanche, des agrégats de formation de biofilm ont été observés en présence de plasma dans les deux souches de S. aureus. La structure de ce biofilm plasmatique après 3 heures dans le système flow-cell était similaire au biofilm plasmatique dans un état statique à 12 heures (Fig. 2)., Cependant, dans l’état de la cellule d’écoulement, le détachement du biofilm plasmatique agrégé a été observé aux points d’incubation ultérieurs (données non présentées).

pénétration et accumulation de vancomycine dans le biofilm de S. aureus

Les souches BAA1556 et N315 ont été incubées en milieu TSBG en présence ou en absence de 0,78% de plasma. Le milieu de culture a été rafraîchi toutes les heures pendant 6 heures. Dans l’état témoin, la structure du biofilm avec ou sans plasma a été examinée par COCRM (Fig. 4-i). Ensuite, de la vancomycine marquée par fluorescence verte a été ajoutée à la culture et le biofilm a été observé pendant 1 heure supplémentaire., La pénétration et l’accumulation de vancomycine ont été comparées en présence ou en absence de plasma par microscopie confocale à balayage laser. Comme prévu, des différences frappantes dans les structures du biofilm ont été observées entre les échantillons avec ou sans plasma. L’ajout de vancomycine fluorescente verte a encore souligné les différences entre les biofilms avec ou sans plasma. Dans le biofilm sans plasma, la distribution diffuse de la fluorescence verte a été observée dans les deux souches., En revanche, des structures rugueuses à la surface, irrégulièrement colorées par fluorescence verte, ont été observées dans le biofilm cultivé en présence de plasma (Fig. 4-ii). Dans le biofilm de S. aureus à l’état sans plasma, une diffusion et une forte fluorescence verte ont été observées 5 minutes après l’administration de vancomycine, qui s’est intensifiée à des moments ultérieurs. En revanche, le biofilm plasmatique présentait des caractéristiques de coloration différentes chez les deux souches de S. aureus., La fluorescence verte a été faiblement observée dans le biofilm plasmatique à 5 minutes, puis l’accumulation de fluorescence verte a augmenté progressivement. Ces données démontrent un retard dans la pénétration et l’accumulation de vancomycine dans le biofilm plasmatique, par rapport au biofilm sans plasma (Fig. 4-iii).

évaluation de l’accumulation de daptomycine dans le biofilm de S. aureus au fil du temps

Nous avons utilisé de la daptomycine marquée par fluorescence verte et examiné la pénétration et l’accumulation de daptomycine dans les biofilms de S. aureus. Étant donné que l’intensité de fluorescence de la daptomycine était plus faible que celle de la vancomycine, une concentration plus élevée de daptomycine a été utilisée dans l’expérience., Dans le biofilm formé en l’absence de plasma, la fluorescence verte était visible de 10 à 20 minutes, et après cela, l’intensité de fluorescence a augmenté de manière dépendante du temps pour les deux souches de S. aureus. Inversement, la fluorescence verte était difficilement détectable dans le biofilm plasmatique, même après 60 minutes d’incubation (Fig. 5). Ces données suggèrent qu’il a retardé la pénétration et l’accumulation de daptomycine dans le biofilm plasmatique, par rapport au biofilm sans plasma., Malheureusement, nous n’avons pas pu comparer les données entre la vancomycine et la daptomycine, en raison des différences dans les intensités de fluorescence verte des antibiotiques.

l’Effet des antibiotiques sur les bactéries montant dans le biofilm formé avec ou sans plasma

Nous avons comparé l’activité bactéricide des antibiotiques sur les biofilms formés avec ou sans plasma. Avant le traitement, des nombres de cellules bactériennes similaires ont été récupérés à partir de biofilms plasmatiques et sans plasma., Ce résultat suggère que la quantité de formation de BF a augmenté proportionnellement à l’ampleur de l’accumulation de composants extracellulaires, y compris la protéine du facteur de coagulation, mais indépendamment du nombre de cellules bactériennes adhérentes. Les antibiotiques anti-SARM vancomycine, daptomycine ou linézolide, avec la rifampicine ont réduit le nombre de bactéries dans le biofilm sans plasma. Cependant, les biofilms plasmatiques des deux souches de S. aureus étaient généralement plus résistants aux antibiotiques, même en association avec la rifampicine., Pour la souche BAA1556, aucune condition n’a induit une réduction de plus de deux logarithmes du nombre bactérien, alors que la souche N315 a montré une réduction significative du nombre bactérien dans le biofilm plasmatique en présence de rifampicine, de vancomycine avec la rifampicine et de daptomycine avec la rifampicine (Fig. 6). Ces résultats suggèrent que les biofilms plasmatiques sont plus résistants à l’activité bactéricide des antibiotiques anti-SARM examinés. Nous avons également effectué une coloration de viabilité pour différencier les cellules vivantes et mortes dans les échantillons ci-dessus., Certains résultats de coloration concordaient avec le nombre de bactéries, mais il y avait plusieurs écarts entre la coloration et le nombre de bactéries (fig. S1).

Discussion

la méthode COCRM a été appliquée pour la première fois pour l’observation du biofilm de S. aureus, qui a montré la croissance rapide des biofilms en présence de plasma. Une pénétration ou une accumulation d’antibiotiques retardée et une résistance à l’activité bactéricide des agents anti-SARM ont également été observées dans les biofilms plasmatiques., Ces résultats suggèrent que le biofilm plasmatique est sensiblement différent morphologiquement et biologiquement du biofilm sans plasma.

Comme indiqué dans la Fig. 1, la présence de plasma a amélioré la formation de biofilm à 6 heures dans les deux souches de S. aureus, même à une concentration aussi faible que 0,09% de plasma. À des moments ultérieurs, la formation de biofilm a été améliorée pour la souche BAA1556 en présence de 3,12% ou plus de plasma, mais pas pour la souche N315. Inversement, une tendance à la réduction de la masse du biofilm a été observée pour la souche N315 à des concentrations plasmatiques plus élevées., Étant donné que la méthode de coloration au violet cristallin évalue la fixation du biofilm aux puits de microplaque, il est probable que le détachement du biofilm et la formation d’un nouveau biofilm pourraient refléter la masse totale du biofilm. Nous avons donc observé la dispersion ou le détachement du biofilm dans le système de cellules d’écoulement et par incubation statique, en particulier à des concentrations plasmatiques plus élevées aux points d’incubation ultérieurs (données non présentées).,

dans le système de cellules d’écoulement observé par COCRM, le biofilm agrégé a été observé dans les 3 heures suivant l’incubation, ce qui était similaire à 12 heures d’incubation du biofilm plasmatique à l’état statique. Un apport continu de plasma imite probablement plus étroitement l’Environnement in vivo, ce qui pourrait accélérer la formation de biofilm dans le système flow-cell. COCRM est une technique nouvellement développée13 qui nous a permis d’observer le déroulement temporel de la maturation et du détachement des biofilms sans utiliser de colorants fluorescents., Par conséquent, le COCRM pourrait être utilisé comme un outil puissant pour analyser le mécanisme de formation du biofilm et pour évaluer les stratégies thérapeutiques potentielles dans la recherche sur le biofilm.

Nous avons observé des différences significatives entre l’accumulation de vancomycine et de daptomycine entre le biofilm plasmatique et le biofilm sans plasma. Jefferson et coll. a rapporté que bien que la vancomycine se lie aux bactéries flottantes dans l’eau en 5 minutes, il a fallu plus de 1 heure pour lier les cellules dans les couches les plus profondes d’un biofilm sans plasma.,16 dans des expériences de biofilm sans plasma, à des concentrations thérapeutiques de vancomycine, la matrice de biofilm n’était pas un obstacle à la diffusion de la vancomycine.17 cependant, lorsque des puits recouverts de plasma humain ont été utilisés, une sensibilité accrue au médicament a été observée de façon transitoire dans la phase précoce (≤24 heures), alors que des biofilms plus anciens et denses ont montré un niveau élevé de résistance aux moments ultérieurs (>48 heures).6 Cardile et coll. a démontré que l’exposition de S., aureus au plasma a entraîné une augmentation significative des composants de surface microbienne, et les biofilms augmentés de plasma ont montré une tolérance accrue à la vancomycine par rapport au biofilm cultivé dans des milieux sans plasma.7 de plus, dans le modèle murin d’infections de greffons vasculaires prothétiques, la daptomycine était inefficace pour éradiquer les biofilms, car la matrice agissait comme un bouclier contre la diffusion des antibiotiques.18 Ces résultats suggèrent que S., la résistance ou la tolérance liée au biofilm d’aureus aux agents anti-SARM pourrait être liée à de multiples facteurs, tels que la présence de plasma, le temps d’incubation, la modification de la structure de surface bactérienne et les différences de souche.

Nous avons observé une activité bactéricide réduite avec les antibiotiques anti-SARM dans le biofilm plasmatique, par rapport au biofilm sans plasma dans les deux souches. Bien que la quantité de formation de biofilm ait augmenté en présence de plasma, le nombre de bactéries n’a pas augmenté., On pense que l’augmentation de la formation de biofilm obtenue à l’aide de composants plasmatiques interfère avec l’activité de l’agent antimicrobien. Dans la souche N315, l’ajout de rifampicine a augmenté l’activité bactéricide de la vancomycine et de la daptomycine, mais son effet a été faible avec la souche BAA1556. Bien que la présente étude ait examiné deux souches différentes, CA-MRSA (BAA1556) et HA-MRSA (N315), il est nécessaire d’examiner plus de souches pour mieux comprendre les différences de souches et les mécanismes de résistance et pour identifier des combinaisons thérapeutiques efficaces pour le biofilm plasmatique.,

dans cette étude, nous avons utilisé du plasma de lapin pour analyser le biofilm plasmatique. Cependant, le plasma humain doit être utilisé pour clarifier le comportement réel du biofilm plasmatique dans le corps humain. De plus, le plasma a été utilisé à faible concentration (0,39 − 7,14%) parce que le plasma à forte concentration provoque la coagulation du milieu par la coagulase du SARM, ce qui entrave l’évaluation du biofilm plasmatique. Cependant, une augmentation significative de la quantité de formation de biofilm a été confirmée dans ces conditions de protéine facteur de coagulation réduite, par rapport au sang., Un système de coagulation pourrait être activé in vivo, et donc d’autres études pour étudier les conditions plus proches du corps humain sont nécessaires à l’avenir.

En conclusion, nous avons signalé les effets du plasma sur la formation de biofilms de CA-SARM et HA-SARM. Les données montrent que le plasma est un facteur crucial pour déterminer non seulement la masse du biofilm lui-même, mais aussi la nature biologique du biofilm, y compris la sensibilité à la pénétration ou à l’accumulation d’antibiotiques et la résistance aux médicaments anti-SARM., Ces résultats soulignent en outre l’importance des biofilms plasmatiques dans la compréhension des obstacles associés à l’éradication et au traitement en milieu de chevet. Les biofilms plasmatiques formés dans le modèle flow-cell pourraient représenter une condition expérimentale cliniquement pertinente, et l’application de COCRM facilite une analyse plus approfondie des mécanismes de formation de biofilms et permet de dépister de nouvelles stratégies pour lutter contre les infections à SARM.

Déclaration

Aucun conflit d’intérêts financiers existent.

Matériel Supplémentaire

Complémentaire Figure S1