La supplémentation chronique en nicotinamide riboside est bien tolérée et élève le nad+ chez les personnes d’âge moyen et âgées en bonne santé

approbation éthique, consentement éclairé et lieu de l’étude

toutes les procédures ont été approuvées par le Conseil D’examen institutionnel de L’Université du Colorado à Boulder. La nature, les avantages et les risques de l’étude ont été expliqués à tous les sujets, et leur consentement éclairé écrit a été obtenu avant la participation., Toutes les mesures ont été effectuées à L’Université du Colorado Boulder Clinical & Translational Research Center (CTRC) et dans le Laboratoire de physiologie intégrative du vieillissement. L’étude a été enregistrée le ClinicalTrials.gov sous l’identifiant NCT02921659.

les participants à L’étude

Les hommes D’âge moyen et plus âgés et les femmes ménopausées âgées de 55 à 79 ans ont été recrutés à Boulder au Colorado et dans les communautés environnantes. Tous les sujets étaient exempts de maladies cliniques, y compris les maladies artérielles périphériques (index cheville-brachial >0.,90) et une MCV manifeste évaluée par un test d’exercice gradué, un panel sanguin de base, des antécédents médicaux et un examen physique par un médecin., Tous les sujets ont présenté des altérations de la fonction endothéliale vasculaire liées à l’âge (définies comme une valeur de dilatation induite par l’écoulement <6%) et ont été exclus s’ils présentaient des chimies sanguines anormales pour la fonction rénale ou hépatique (définies comme un écart type de 1 en dehors de la plage normale), poids non stable pendant au moins 3 mois avant l’inscription à l’étude (défini comme >2 kg de variation de la masse corporelle)., La masse corporelle, L’IMC et les circonférences de la taille et de la hanche ont été mesurés par anthropométrie, et le pourcentage total de graisse corporelle a été mesuré à l’aide de l’absorptiométrie aux rayons X à double énergie (Lunar/Prodigy, GE). Le glucose à jeun et les taux de cholestérol total, LDL et HDL ont été mesurés à l’aide de tests normalisés au laboratoire central du CTRC de L’Université du Colorado à Boulder à l’inclusion et après chaque phase d’intervention de l’étude.

plan de l’étude, randomisation et intervention

le plan de l’étude consistait en un essai clinique croisé randomisé de 2 × 6 semaines, en double aveugle et contrôlé par placebo., Sujets ayant ingéré du chlorure de Nicotinamide riboside (NIAGEN®; 500 mg, deux fois par jour; ChromaDex, Inc.) et des capsules placebo pendant 6 semaines chacune dans un ordre déterminé au hasard. Les sujets ont été randomisés après avoir donné leur consentement éclairé et satisfait à tous les critères d’inclusion. La randomisation a été effectuée par un membre de l’équipe de l’étude qui n’a pas participé à l’évaluation des résultats. Les participants à l’étude et les membres de l’équipe impliqués dans la collecte et l’analyse des résultats ont été aveuglés à un traitement. Les Capsules ont été consommées avec les repas le matin et le soir., Les sujets se sont abstenus de prendre des médicaments en vente libre pendant 48 h et des médicaments sur ordonnance pendant 24 h avant tous les tests expérimentaux. Toutes les évaluations ont été effectuées après un jeûne de 12 h pendant la nuit, à l’exception des tests de la fonction motrice, qui ont été effectués 2 h après un repas léger ou une collation afin de s’assurer que les sujets avaient assez d’énergie pour compléter la batterie de test. Les sujets se sont abstenus de consommer de l’alcool ou de faire de l’exercice vigoureux pendant 24 h et se sont abstenus de prendre des pilules d’étude pendant au moins 12 h avant toutes les séances de test.,

évaluation de l’innocuité et de la tolérabilité

l’observance de l’intervention a été évaluée par numération des comprimés. Les sujets se sont présentés au laboratoire toutes les 2 semaines pour recevoir une nouvelle bouteille de capsules et pour discuter de tout problème de tolérance ou D’ei émergeant du traitement avec un membre de l’équipe de recherche qui n’a pas participé à la collecte ou à l’analyse des données afin d’assurer l’aveuglement des chercheurs., Les marqueurs cliniques Standard de l’Hématologie, de la fonction hépatique et rénale et des lipides sanguins ont été analysés à l’aide d’essais cliniques normalisés à L’Hôpital communautaire de Boulder et tout résultat sanguin anormal a été examiné par le médecin de l’étude.

isolement de cellules mononucléaires du sang périphérique

des PBMC ont été isolés à partir de 35 ml de sang total prélevés dans des tubes Vacutainer™ revêtus D’EDTA. Le sang a ensuite été centrifugé à 400 × g pendant 20 min et la majorité de la couche de plasma (~60%) a été retirée pour augmenter l’efficacité de l’isolation PBMC en aval., L’échantillon restant a été ajouté lentement à un nouveau tube conique de 50 ml contenant 10 ml D’Histopaque 1.077 (Greiner Bio-One) et la couche cellulaire mononucléaire a été isolée par centrifugation dépendant de la densité à 400 × g pendant 20 min, lavée puis congelée dans 2 ml de PBS à -80°C.

matériaux

préparation des étalons d’étalonnage

les étalons de stock individuels ont été préparés en dissolvant 10 mg ml-1 dans 1:1 méthanol:eau puis combinaison pour obtenir un mélange de stock., Le stock combiné NAD + métabolite a été préparé à 100 µg ml−1 de chaque composé et le stock combiné nucléoside/nucléotide a été préparé à 400 µg ml−1 de chaque composé; les deux ont été congelés à -20 °C jusqu’à leur utilisation. La solution étalon interne a été préparée à 250 µg/ml d’adénosine-13c5, d’adénosine triphosphate-D4, de nicotinamide riboside doublement marqué et à 2,5 µg ml−1 de NaM-13c6 dans du méthanol 1:1:eau., Immédiatement avant l’analyse de chaque lot d’échantillons, les étalons de courbe d’étalonnage individuels ont été préparés en combinant les stocks de NAD+ et de nucléoside/nucléotide dans un rapport de 1:1, puis en les diluant dans du méthanol 1:1:eau aux concentrations requises. Les Concentrations variaient de 0,025 à 25 µg ml−1 pour les métabolites NAD+ et de 0,1 à 100 µg ml−1 pour les nucléosides/nucléotides. Les concentrations étalon internes dans tous les niveaux et échantillons d’étalonnage étaient de 50 µg ml−1 pour l’adénosine-13c5, l’adénosine triphosphate-D4 et le nicotinamide riboside doublement marqué, et de 0,5 µg ml−1 pour le NaM-13c6.,

Extraction des métabolites NAD+ et des nucléosides/nucléotides

les PBMC congelés (5×10e6 cellules au total) ont été décongelés sur de la glace. 500 µl de méthanol glacé à 70:30:de l’eau ont été ajoutés avec 20 µl d’étalon interne et des échantillons vortexés pendant 10 s. l’extrait résultant a été centrifugé à 8000 × g pendant 5 min à 4 °C. Le surnageant résultant a été transféré dans un nouveau tube à centrifuger et stocké sur de la glace. À la pastille restante, 500 µl de méthanol glacé ont été ajoutés et l’échantillon vortexé pendant 10 s pour remettre la pastille en suspension. L’échantillon a ensuite été centrifugé à 8000 × g pendant 5 min à 4 °C., Le surnageant entier a été enlevé et combiné avec le surnageant de méthanol de 70%. La pastille résultante a été réservée et congelée à -70 °C pour l’analyse de la concentration en protéines à L’aide du test de Bradford. Les surnageants combinés ont été centrifugés à 18 000 × g pendant 15 min et le surnageant résultant a été transféré dans un nouveau tube et séché dans une centrifugeuse sous vide à 55 °C. Les échantillons séchés ont été reconstitués dans 100 µl de méthanol 1:1:eau et centrifugés à 18 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant a ensuite été transféré dans un flacon d’échantillonneur automatique à activité de surface réduite pour analyse.,

LC-MS

la séparation par CLHP des métabolites NAD+ et des nucléosides/nucléotides a été réalisée à l’aide d’une méthode décrite par Evans et al.59 avec des modifications mineures. La séparation des métabolites NAD+ et des nucléosides / nucléotides a été réalisée sur une CLHP de la série 1200 d’Agilent (Santa Clara, CA) À l’aide d’une colonne Luna NH2 de 100 × 2 mm 5 µm de Phenomenex (Torrance, CA) fonctionnant en mode HILIQUE. Le tampon A était composé à 100% d’acétonitrile et le tampon B était composé d’eau à 95:5 avec de l’acétate d’ammonium de 20 mm ajusté à pH 9,6 avec de l’hydroxyde d’ammonium de 20 mm., Dix microlitres de l’échantillon extrait ont été analysés en utilisant le gradient suivant à un débit de 0,6 ml par min: gradient linéaire de 5 à 100% B sur 6 min, maintien à 100% B de 6 à 9,5 min, puis 100-5% B de 9,5 à 10,5 min, suivi d’un rééquilibrage à 5% B de 10,5 à 14 min. La température de la colonne a été maintenue à 15 °C pendant tout le gradient. Une analyse spectrométrique de masse a été réalisée sur un spectromètre de masse Triple quadripôle Agilent 6410 en mode d’ionisation positive. Le gaz de séchage était de 300 °C à un débit de 12 ml par minute. La pression du nébuliseur était de 30 psi., La tension capillaire était de 4000 V. Les données pour les métabolites NAD+ et les nucléosides/nucléotides ont été acquises en mode MRM en utilisant des conditions expérimentalement optimisées obtenues par l’analyse par injection de flux d’étalons authentiques (tableau supplémentaire 5). Les étalons d’étalonnage ont été analysés pour une gamme de concentrations allant de 0,25 à 250 ng sur colonne pour les métabolites NAD+ et de 1 à 1000 ng sur colonne pour les nucléosides/nucléotides. Des courbes d’étalonnage pour chaque métabolite NAD+ et nucléoside/nucléotide ont été construites à l’aide du logiciel D’analyse Quantitative Agilent Masshunter., Les résultats pour les PBMC ont été quantifiés à l’aide des courbes d’étalonnage pour obtenir la concentration sur colonne, suivie d’une normalisation des résultats à l’aide de la concentration en protéines de la pastille réservée de l’extraction des PBMC.

évaluations de la fonction cardiovasculaire

La pression artérielle au repos a été mesurée en position assise après au moins 10 min de repos silencieux à l’aide d’un appareil de pression artérielle semi-automatisé (Dynamap™ XL, Johnson& Johnson, Arlington, TX, USA)., Les mesures ont été faites plusieurs fois à partir du bras non dominant, avec 2 min de repos silencieux entre les enregistrements. Des mesures répétées ont été effectuées jusqu’à ce que trois valeurs de pression artérielle soient obtenues à moins de 5 mmHg l’une de l’autre. Ces valeurs ont ensuite été moyennées pour déterminer la pression artérielle systolique et diastolique au repos et la pression du pouls. Les valeurs de tension artérielle de base ont été obtenues à l’aide du protocole décrit ci-dessus lors de deux jours d’essai distincts avant le début du premier bras d’intervention et ont été moyennées pour déterminer l’état de tension artérielle de base (c.-à-d., au-dessus de la normale) pour des analyses ultérieures.

la rigidité aortique a été mesurée à l’aide du PWV carotide-fémorale, l’évaluation de référence de la rigidité élastique de l’artère chez l’homme38. Les formes d’ondes de pression ont été enregistrées simultanément à partir des artères carotide et fémorale à l’aide de la tonométrie d’applanation (Millar Inc., Houston, Texas) comme décrit précédemment par notre laboratoire60, 61, 62. Le temps de transit de l’onde de pouls aortique a été déterminé en mesurant le délai entre le pied des ondes de pression carotide et fémorale à l’aide du logiciel D’analyse LabChart., Le PWV a été calculé en divisant la distance entre les deux sites de mesure par le temps de transit aortique.

la conformité de l’artère carotide a été déterminée par la variation du diamètre de l’artère carotide commune droite (évaluée à l’aide d’une échographie à haute résolution, PowerVision 6000, Toshiba) par rapport à la variation de la pression artérielle carotidienne (évaluée à l’aide de la tonométrie applanation, Millar Inc., Houston, TX) à travers le cycle cardiaque., La pression carotidienne a été normalisée à la pression artérielle brachiale obtenue à l’aide d’un brassard de pression artérielle automatisé (Dynamap™ XL, Johnson & Johnson, Arlington, TX, USA). La conformité a été calculée comme CC = π × DD2 × (ΔD DD-1) / (2 × PP), où DD est le diamètre diastolique, ΔD est le changement de diamètre et PP est la pression du pouls artériel, comme cela a été décrit précédemment62,63,64,65.,

la dilatation dépendante de L’endothélium a été mesurée sous forme de dilatation provoquée par le flux de l’artère brachiale (FMD) en hyperémie réactive, à l’aide d’une échographie à haute résolution (PowerVision 6000, Toshiba), comme décrit antérieurement66,67, 68. La fièvre aphteuse a été exprimée en pourcentage de variation (%Δ) par rapport au diamètre de référence.

évaluations de la fonction métabolique

des enregistrements alimentaires de trois jours ont été recueillis à l’inclusion et au cours de la dernière semaine de chaque phase d’intervention pour assurer la stabilité de l’apport calorique., Les résultats ont été analysés par un diététicien agréé à l’aide du Nutrition Data System for Research (Université du Minnesota) tel que décrit précédemment par notre laboratoire67,69.

le taux métabolique au repos a été mesuré par calorimétrie indirecte (ParvoMedics TrueOne 2400) comme décrit précédemment par notre laboratoire70,71. Les sujets se sont reposés en décubitus dorsal pendant 45-60 min avec une hotte ventilée placée sur leur tête pour recueillir les concentrations d’oxygène expiré (O2) et de dioxyde de carbone (CO2)., Le taux métabolique et le rapport d’échange respiratoire (RER) ont été calculés en segments de 1 min et ont été moyennés à partir d’au moins 30 min de données stables.

la sensibilité à l’insuline a été évaluée en mesurant l’absorption de glucose dans le corps entier stimulée par l’insuline à l’aide d’un test de tolérance au glucose par voie intraveineuse fréquemment échantillonné modifié et de la méthode D’analyse Modèle Minimal décrite en détail ailleurs72. La résistance à l’insuline et la sensibilité des cellules bêta ont été évaluées à l’aide de la méthode homeostasis model assessment (HOMA) décrite antérieurement73.,

évaluations de la capacité d’exercice et de la fonction physique

l’aptitude cardiorespiratoire a été déterminée à partir d’un test d’exercice gradué sur tapis roulant jusqu’à l’épuisement volontaire à l’aide d’un protocole de Balke modifié tel que décrit antérieurement74. La consommation d’oxygène (VO2) et le RER ont été mesurés à l’aide d’une spirométrie en circuit ouvert avec un système d’analyse en ligne assisté par ordinateur. La fréquence cardiaque et les évaluations de l’effort perçu (EPR) ont également été mesurées tout au long du test.,

l’endurance à la marche a été évaluée en mesurant la distance parcourue au cours d’une tâche de marche de 6 minutes sur un parcours intérieur de 50 pieds (aller-retour) tel que décrit antérieurement75.

la force musculaire et le taux de développement du couple ont été quantifiés en mesurant la force maximale produite lors d’une contraction volontaire maximale, et le taux de développement du couple a été mesuré en utilisant le taux maximal de développement du couple lors d’une contraction rapide et énergique des muscles fléchisseurs et extenseurs du genou, tel que décrit La force de la poignée a été mesurée à l’aide d’un dynamomètre à poignée standard.,

la fatigabilité des jambes a été évaluée en utilisant la performance jusqu’à l’échec lors d’une tâche de montée du talon d’une seule jambe. Les sujets ont été invités à effectuer une contraction complète de la flexion plantaire toutes les 2 s jusqu’à l’échec, et le test a été interrompu lorsque le sujet s’est arrêté volontairement en raison d’une gêne ou d’une incapacité à atteindre au moins 50% de la flexion plantaire maximale sans utiliser les membres supérieurs pendant plus d’équilibre77. L’attribut chronique de la fatigue a également été évalué à l’aide d’un Questionnaire sur la Fatigue et D’une échelle de gravité de la Fatigue78.

l’équilibre dynamique a été évalué à l’aide d’un test de pas rapide., La longueur maximale du pas a été mesurée dans chaque direction (avant, arrière, gauche, droite), et les cibles ont été placées au sol à 80% du maximum du sujet avec des lignes de ruban coloré, comme décrit précédemment 79. La Performance a été quantifiée en fonction du temps pris et du nombre d’erreurs commises en moyenne pendant trois cycles du test d’équilibre par étapes rapides. Chaque tour consistait en 18 commandes demandant aux sujets de marcher avec un pied aléatoire dans une direction aléatoire (c’est-à-dire avant gauche)., Une erreur a été définie comme un défaut de dépasser complètement la cible, une perte d’équilibre, un défaut de revenir à la position de départ initiale, de faire plusieurs pas pour atteindre complètement une cible, ou de marcher avec la jambe incorrecte ou vers la mauvaise cible.

la mobilité a été évaluée comme étant le temps nécessaire pour accomplir une tâche de 4 m de marche (effectuée en double à la vitesse de marche préférée des sujets) et le test assis-debout à cinq reprises (effectué en trois exemplaires), tel que décrit antérieurement75,78,80., Le test consiste à se lever d’une position assise dans une chaise de hauteur standard cinq fois, le plus rapidement possible, sans utiliser leurs bras pour l’élan ou le soutien.

la dextérité manuelle a été évaluée comme étant le temps nécessaire pour effectuer un essai de panneau perforé à 9 trous tel que décrit antérieurement76. Les sujets ont recueilli des chevilles lisses et arrondies dans un plat et les ont placées dans un panneau perforé, puis les ont retournées dans le plat le plus rapidement possible. Deux essais ont été effectués avec chaque main.,

analyses statistiques

La Taille de l’échantillon pour cette étude était suffisante pour détecter une augmentation d’au moins 50% de la concentration de NAD+ après la supplémentation en NR par rapport au placebo (taille de l’effet = 0,7; moyenne de différence = 7; 1−β = 0,8; α = 0,05) ainsi qu’une amélioration cliniquement pertinente du paramètre cardiovasculaire avec la taille d’effet la plus faible (fièvre aphteuse; différence moyenne = >1%; Taille de l’effet = 0,86). L’estimation de la taille de l’effet pour le NAD+ a été déterminée à partir de données préliminaires sur les concentrations de métabolite de NAD+ dans les PBMC recueillies chez des sujets humains., La taille de l’effet de la fièvre aphteuse a été déterminée à partir des interventions croisées précédentes de notre laboratoire démontrant des améliorations de la fonction vasculaire67. La taille d’échantillon requise a été déterminée à 19 sujets. En supposant un taux d’abandon de 20% (4 sujets) et une exclusion de 40% en raison d’Échecs de dépistage (en accord avec d’autres études d’intervention dans notre laboratoire utilisant des suppléments diététiques81,82), un total de 60 participants ont été consentants pour cette étude. La signification a été fixée à α = 0,006 pour tous les résultats secondaires afin de tenir compte des tests multiples de NR vs., placebo (tests t appariés) sur chacune des neuf hypothèses pré-spécifiées suivantes: (1) métabolites NAD+, (2) paramètres cardiovasculaires, (3) Hématologie, (4) panneau métabolique, (5) profils lipidiques, (6) bilan énergétique, (7) contrôle glycémique, (8) fonction motrice et (9) performance à l’exercice. Étant donné que bon nombre des mesures de chaque hypothèse sont corrélées les unes aux autres (p. ex., mesures cardiovasculaires, tableau supplémentaire 9), chaque groupe de mesures énumérées ci-dessus a été traité comme un résultat lors de l’Ajustement pour tenir compte de comparaisons multiples., À l’exception de nos principales variables de résultat (métabolites NAD+: NAD+, NAAD, NADP, NaM, NMN), dans lesquelles les inférences étaient basées sur un niveau alpha non ajusté fixé à 0,05, toutes les inférences significatives sont basées sur le niveau alpha ajusté par Bonferroni (α = 0,006).

l’objectif de cette étude était de traduire les preuves précliniques prometteuses de l’efficacité de la supplémentation chronique en composés stimulants NAD+ chez l’homme. Par conséquent, chaque résultat a été testé selon une hypothèse directionnelle qui a été déterminée a priori, basée sur des études antérieures rapportées dans la littérature., Par conséquent, des tests d’hypothèse à une queue ont été utilisés pour comparer les effets unidirectionnels proposés de la supplémentation en NR par rapport au placebo sur ces résultats. Cette méthode a été recommandée ailleurs pour les essais cliniques de Phase I et II contrôlés par placebo dans lesquels l’objectif est d’obtenir un aperçu précoce de l’efficacité potentielle d’un compound83.

avant l’analyse, Toutes les variables continues des résultats ont été évaluées pour leur normalité à l’aide du test de Shapiro−Wilk et en examinant des histogrammes de fréquence individuels pour chaque résultat., Si une variable n’était pas normalement distribuée, elle était transformée en log avant l’analyse. Si la transformation logarithmique n’a pas normalisé les données, l’état du traitement a été analysé à l’aide du test de rang signé de Wilcoxon non paramétrique. Pour chaque variable, tout sujet ayant une valeur manquante au cours de l’une ou l’autre phase a été exclu de cette analyse. Sur la base de l’interprétation des données primaires, des analyses post-hoc ont été effectuées pour comparer la variation de la pression artérielle et de la raideur aortique entre les sujets qui présentaient une pression artérielle normale par rapport à une pression artérielle supérieure à la normale de base à l’aide d’un test T à deux queues non apparié., Nous avons également exploré la relation entre les concentrations initiales de NAD+ et l’augmentation globale de NAD+ à l’aide d’une corrélation de Pearson. Cependant, compte tenu du plan de croisement, nous avons testé la présence d’un effet de report pour chacun des résultats étudiés en utilisant une régression linéaire modélisée avec un indicateur de l’ordre de traitement (aucun effet de report n’a été observé entre les conditions). Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de la plateforme de calcul statistique R (version 3.2.2) et du logiciel GraphPad Prism 7.

la disponibilité des Données