Une Étude Comparative sur les Différentes Méthodes de Coloration et le Nombre de Spécimens pour la Détection de Bacilles acido-alcoolo

Vol. 95 (6): 855-858, Nov./Dec., 2000

Mustafa Ulukanligil+, Gonul Aslan, Sami Tasçi

Département de microbiologie, école de Médecine de L’Université Harran, Sanliurfa, Turquie

la présence de bacilles acido-rapides dans plusieurs échantillons a été étudiée comparativement avec la coloration Ziehl-Neelsen (ZN) et la microscopie à fluorescence (FM) afin de déterminer la sensibilité dans la détection de la tuberculose (TB). Au total, 465 échantillons prélevés sur 295 patients ont été analysés à L’Hôpital Universitaire de Médecine de Harran entre mars 1998 et mars 2000. La culture a été utilisée comme méthode de référence. Soixante-huit patients (23.,1%) ont été diagnostiqués comme atteints de tuberculose par culture. Les sensibilités à la coloration ZN et FM étaient respectivement de 67,6% (46/68) et de 85,2% (58/68). Deux cent Un patients (68,1%) ont soumis un échantillon au laboratoire. La positivité de la tuberculose a été détectée chez 42 (20,9%) de ces patients par culture. Les sensibilités des taches ZN et FM se sont révélées à 61% et 83% chez ces patients. Cependant, chez 18 patients (6,1%) qui ont soumis deux échantillons au laboratoire, la tuberculose était positive chez six d’entre eux (33,3%) et les sensibilités ZN et FM étaient respectivement de 66% et 83%., Lorsque trois échantillons ou plus ont été prélevés chez les patients (76 patients, 25,8%), la positivité de la tuberculose a été déterminée chez 20 d’entre eux (26,3%) et les sensibilités étaient respectivement de 80% et 92% dans les frottis Zn et FM.

nos données indiquent que dans le diagnostic de TB, FM a une plus grande sensibilité que ZN. En particulier, dans le cas d’un seul échantillon, la valeur diagnostique de FM est assez significative. Il est donc possible de conclure que la coloration ZN et FM peut être utilisée pour le diagnostic de la tuberculose lorsqu’il y a plus de deux échantillons., Cependant, si seulement un ou deux échantillons sont disponibles, la coloration FM est préférable.

mots clés: Mycobacterium tuberculosis – sensibilité – Ziehl Neelsen – microscopie à fluorescence

La tuberculose reste un problème de santé majeur, avec une estimation de 8 millions de nouveaux cas et 3 millions de décès dus à cette maladie chaque année dans le monde (Dixie et al.1993). Trois cents à quatre cents nouveaux cas sont signalés chaque année à Sanliurfa, en Turquie, sur une population de 400 000 habitants (S. urfa tuberculosis dispensary statistics report, 1998)., Plusieurs facteurs sont responsables de l’épidémie de tuberculose dans la région: la détérioration des conditions socio-économiques, avec un faible revenu et une éducation inadéquate, et une grande ignorance de la maladie, comme le montre le fait que les patients arrêtent souvent de prendre des médicaments lorsque leurs symptômes ont disparu. Bien que le virus de l’immunodéficience humaine soit le principal facteur des épidémies de tuberculose dans des endroits comme les États-Unis et L’Afrique, il est assez rare dans le sud de la Turquie.

la Plupart des manuels de laboratoire (Janda 1997, Sommers et coll., 1988) et des lignes directrices pour les laboratoires de mycobactériologie (Kent & Kubica 1985) suggèrent qu’au moins trois échantillons, prélevés de préférence sur trois jours consécutifs, devraient être soumis au laboratoire pour un frottis et une culture de bacilles acido-rapides (AFB) par des patients soupçonnés d’avoir la tuberculose. La détection de L’AFB dans des frottis directs préparés avec du sputa concentré, de l’urine et des échantillons d’autres fluides corporels a une valeur clinique et épidémiologique considérable et reste le test de diagnostic rapide de la tuberculose le plus largement utilisé dans la plupart des pays en développement (Nelson et al. 1998)., Bien que de nouvelles techniques de diagnostic radiométrique et moléculaire aient été développées et soient largement utilisées dans les pays développés (Heifets, 1997), on estime qu’entre 60% et 70% de tous les cas de tuberculose sont diagnostiqués au moyen d’un frottis d’expectoration (Guthie et al. 1993). Deux méthodes traditionnelles de coloration, à savoir la microscopie à fluorescence (FM) et la méthode Ziehl-Neelsen (ZN) sont facilement disponibles (Nagpaul 1967). La méthode ZN a été couramment utilisée dans le monde entier, en particulier dans les pays en développement, en raison de sa simplicité et de son faible coût (Guthie et al. 1993)., Plusieurs rapports (Lempert 1944, Boyd & Marr 1975, Janda 1997) ont indiqué que la FM a une plus grande sensibilité et fait gagner du temps par rapport à la méthode ZN. Un inconvénient de la technique FM est qu’elle peut parfois donner des résultats faussement positifs. Cependant, la plupart d’entre eux peuvent être évités en retenant le frottis selon la méthode ZN pour la microscopie en lumière vive (Holst et al. 1959, Heifets 1997).,

dans la présente étude, ces deux techniques ont été comparées en termes de sensibilité dans le diagnostic de la tuberculose, et la corrélation entre la sensibilité et le nombre d’échantillons prélevés a été examinée. En outre, à la lumière de nos résultats et la littérature disponible, nous avons essayé d’identifier les techniques adaptées à notre situation.,

matériaux et méthodes

résultats

DISCUSSION

matériaux et méthodes

deux cent quatre-vingt-quinze patients soupçonnés d’être atteints de tuberculose ont été dirigés vers notre Clinique (Laboratoire de microbiologie clinique, hôpital de la faculté de médecine de l’université de Harran) et 460 spécimens en ont été prélevés entre mars 1998 et mars 2000., Ces échantillons comprenaient 430 expectorations, 17 urines, 4 échantillons de lavage gastrique et 3 échantillons d’abcès cervical, 3 liquides pleuraux, 1 liquide péritonéal, 1 échantillon de biopsie des ganglions lymphatiques cervicaux et 1 échantillon de sperme.

Tous les échantillons de crachats ont été décontaminés et concentrés en utilisant la procédure de N acétyl-L-cystéine-hydroxyde de Sodium recommandée par le Center of Disease Control and Prevention (Kent& Kubica 1985)., Les expectorations, l’urine et d’autres échantillons ont été préparés à l’aide de la méthode classique de centrifugation et les frottis ont été colorés avec des taches de carbolfuchsine (ZN) et D’Auramin-O (fluorochrome) (Ebersole, 1995). Les expectorations, l’urine et les autres sédiments des échantillons ont été inoculés sur des milieux de Lowenstein-Jensen et incubés à 37oC dans 5% de CO2 pendant une période pouvant aller jusqu’à six semaines (Lambi, 1995). La culture a été utilisée comme méthode de référence et comparée aux techniques ZN et FM., Pour enregistrer les nombres AFB déterminés dans les frottis colorés en microscopie à immersion (grossissement x1000), l’échelle de déclaration suivante a été utilisée: plus de 9 AFB par Champ (4+), 1-9 AFB par Champ (3+), 1-9 AFB par 10 champs (2+), 1-9 AFB par 100 champs (1+). Lorsque seulement quelques AFB ont été détectés dans 300 champs, les résultats ont été considérés comme discutables. Afin d’assimiler le nombre de bacilles observés avec FM (grossissement 400x) au nombre de bacilles observés avec microscopie à immersion (grossissement 1000X), les valeurs ont été divisées par 4 (American Thoracic Society 1981).,

résultats

Deux Cent Un patients (68,1%) ont soumis un échantillon pour examen AFB et dans 42 (20,9%), l’organisme a été isolé à partir d’expectorations (40 cas), de matériel d’abcès (1 cas) et de matériel de biopsie des ganglions lymphatiques (1 cas). Chez ces 42 patients, 28 échantillons d’expectorations ont donné des résultats positifs avec une coloration ZN et 38 (37 expectorations, 1 abcès cervical) ont donné des résultats positifs avec une coloration FM. Les sensibilités de la coloration ZN et FM étaient respectivement de 61% et 83% (p<0,05) (Tableau II).,

nous avons observé que les frottis positifs avec ZN et FM contenaient entre 1 et 9 AFB par champs. Les 14 frottis positifs, qui n’ont pas été détectés avec des frottis colorés au ZN, ont été détectés avec des bacilles de faible densité (1-2 bacilles pour 100 Champs) sur des frottis colorés au FM. Un seul résultat faussement positif a été observé avec la méthode FM, par conséquent, les spécificités de la coloration ZN et FM ont été trouvées à 100% et 99% respectivement.

dix-huit (6,1%) patients ont soumis deux échantillons au laboratoire et chez 33,3% (6 sur 18) de ces patients, l’organisme a été récupéré dans 1 ou 2 des échantillons d’expectorations., Quatre d’entre eux ont produit des résultats positifs avec la coloration ZN (sensibilité, 66%) et 5 ont produit des résultats positifs avec la coloration FM (sensibilité, 83%). Deux patients positifs n’ont pas été détectés sur la base de frottis colorés au ZN. Les frottis d’un patient, qui ont été colorés avec MF, contenaient 3-5 bacilles dans tous les 30-40 champs tandis que les frottis de l’autre patient étaient négatifs avec FM et ZN. Aucun résultat faussement positif n’a été détecté chez ces patients.

trois échantillons ou plus ont été soumis par 25,8% des patients (76 sur 153) et 20 de ces patients (26.,3%) ont été diagnostiqués comme atteints de tuberculose en isolant l’organisme dans un ou plusieurs des échantillons d’expectorations. Seize d’entre eux ont produit des résultats positifs avec la coloration ZN (sensibilité, 80%) et 18 ont produit des résultats positifs avec la coloration FM (sensibilité, 92%). Aucun résultat faussement positif n’a été détecté chez ces patients (Tableau II).

dix-sept échantillons d’urine ont été prélevés pour L’AFB, mais aucun d’entre eux ne s’est révélé positif dans les frottis colorés ou les cultures., De même, d’autres échantillons (3 liquide pleural, 4 lavage gastrique, 1 liquide péritonéal, 2 échantillons d’abcès cervical et 1 échantillon de sperme) se sont révélés négatifs avec la coloration et la culture ZN et FM, à l’exception d’un échantillon d’abcès cervical qui a donné un résultat positif avec la coloration et la culture FM. Un spécimen de ganglion lymphatique cervical a donné M. tuberculosis en culture seulement.

DISCUSSION

la Turquie est un pays en développement et de la TUBERCULOSE reste une maladie commune, en particulier dans le sud-est du comté., À Sanliurfa, une ville du Sud-Est, les conditions économiques sont encore très mauvaises et 300 à 400 nouveaux patients atteints de tuberculose sont enregistrés chaque année.

ces dernières années, plusieurs techniques radiométriques et moléculaires ont été développées pour le diagnostic de la tuberculose. Les techniques radiométriques réduisent le temps de rotation pour AFB. Cependant, ils ne conviennent pas à cette région de la Turquie en raison de leur coût élevé (Heifets 1997). Il y a peu de possibilités même pour utiliser des techniques moléculaires en raison de nos ressources financières limitées. Les méthodes conventionnelles telles que ZN et FM sont des techniques rapides et simples avec un coût assez faible., Jusqu’à présent, seul le ZN a été utilisé pour le diagnostic de la tuberculose dans cette région. Cependant, il a un faible niveau de sensibilité par rapport à la méthode FM. La présente étude a été notre première tentative d’utiliser FM et de la comparer avec ZN.

Nous avons réalisé dans une étude comparative la fiabilité des méthodes FM et ZN dans l’examen des frottis pour AFB. Nous avons constaté que les spécificités de FM et ZN étaient de 99% et 100%, et que les sensibilités avec un échantillon étaient de 83% et 61%, respectivement. Lorsque le nombre d’échantillons a augmenté, la sensibilité des deux types de coloration a augmenté., Lorsque nous avons utilisé plus de deux spécimens, les sensibilités se sont révélées similaires. Par conséquent, il est possible de dire que si nous avons moins de trois échantillons, la fiabilité de FM est beaucoup plus grande que celle de ZN. À moins que plus d’un échantillon n’ait été soumis, ce qui n’était pas facile dans les conditions socio-économiques et culturelles existantes, la FM s’est avérée plus fiable que la méthode ZN. De plus, un autre avantage de FM était qu’il permettait la détection de frottis positifs, qui étaient négligés avec des frottis colorés au ZN contenant des bacilles de faible densité., L’utilisation de FM augmente considérablement la valeur diagnostique du frottis, en particulier lorsqu’il existe des bacilles de faible densité qui peuvent échapper à la détection sur les frottis colorés au ZN. Nos résultats étaient en accord avec ceux de Guthie et al. (1993), Ba et Rieder (1999), et Pollack et Wieman (1977), qui ont signalé que la FM semble être plus susceptible de détecter la tuberculose dans les frottis contenant des bacilles de faible densité.

de Nombreux rapports (Sommers et coll. 1988, Nelson et coll., 1998) ont montré que les mycobactéries peuvent être libérées irrégulièrement des poumons, et qu’il est même possible de trouver des résultats positifs et négatifs chez le même patient au cours de la même période. Par conséquent, il est conseillé de prélever plus d’un échantillon de patients suspectés d’être atteints de tuberculose. Quelques autres rapports (Ozturkeri et al. 1997, Durupinar et coll. 1997, Pollock & Wieman 1997) ont affirmé que des réactions faussement positives pourraient se produire avec FM. Nous n’avons observé qu’un seul résultat faussement positif dans la présente étude., De plus, aucune réaction faussement positive ne s’est produite dans notre enquête avec la méthode ZN.

notre priorité dans cette étude était de trouver une méthode rapide et rentable pour le diagnostic de la tuberculose à Sanliurfa. Nous concluons que la méthode FM est assez économique en termes de temps et de dépenses et elle est recommandée pour les laboratoires manipulant un grand nombre d’échantillons d’expectorations. Nous avons découvert que FM est plus fiable que ZN. Cependant, tout le personnel qui doit examiner les échantillons d’expectorations devrait se familiariser avec la FM afin d’éviter les résultats faussement positifs et/ou négatifs., Par conséquent, il est suggéré que jusqu’à ce qu’il y ait du personnel qualifié pour l’enquête sur L’AFB, les frottis devraient être colorés avec ces deux taches et ensuite examinés comparativement. Une fois que le personnel de laboratoire se familiarise avec la méthode FM, cette méthode peut être utilisée régulièrement seule.

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