Caratteristiche Morfologiche e Biologiche di Staphylococcus aureus Biofilm si Formano in Presenza di Plasma

Introduzione

lo Staphylococcus aureus è un batterio gram-positivi coccus che colonizza la mucosa nasale e la pelle di individui sani.1 Questo organismo può causare una vasta gamma di malattie da infezioni della pelle o dei tessuti molli a malattie sistemiche e fatali.1-3 In particolare, S resistente alla meticillina., aureus (MRSA) è un organismo pericoloso a causa della sua resistenza agli antibiotici multipli e alla capacità di formazione del biofilm. Le infezioni del flusso sanguigno derivate dal sito di infezione focale o dal dispositivo sono esempi di casi gravi di malattie da MRSA. La comparsa di MRSA acquisita in comunità (CA-MRSA), oltre al convenzionale MRSA acquisito in ospedale (HA-MRSA), rappresenta un alto rischio per i pazienti immunocompromessi e gli individui sani.

È noto che i batteri che formano biofilm possono sopravvivere in presenza di alte concentrazioni di agenti antimicrobici.,4 I biofilm batterici sono costituiti da una varietà di componenti e sostanze provenienti sia dai batteri (polisaccaride, peptidoglicano e DNA) che dall’ospite (detriti cellulari, prodotti di coagulazione e DNA). La composizione del biofilm varia a seconda dell’organismo causale e/o dei fattori dell’ospite.

S. aureus possiede un fattore di virulenza specifico chiamato coagulasi, che svolge un ruolo significativo nella formazione di biofilm durante le infezioni da S. aureus., La coagulasi si lega alla protrombina ospite e forma complessi attivi di stafilotrombina, che converte il fibrinogeno monomerico solubile in fibrina insolubile auto-polimerizzante e attiva una cascata di coagulazione.5 Questo fenomeno è stato utilizzato nei laboratori di microbiologia clinica come test di coagulasi per l’identificazione delle specie di stafilococco. Negli ultimi anni, alcuni rapporti hanno suggerito che S. aureus utilizza la fibrina e il fibrinogeno reclutati dalla coagulasi per formare l’impalcatura del biofilm.6

Rapporti precedenti hanno dimostrato meccanismi di resistenza agli antibiotici nei batteri che formano biofilm., Anche in condizioni prive di plasma, i batteri che formano biofilm presentano un’elevata resistenza a una varietà di antibiotici. La barriera all’accumulo e alla penetrazione degli antibiotici dovuta alla struttura del biofilm, oltre alla natura tollerante e statica dei batteri nei biofilm, sono cruciali per la resistenza agli antibiotici negli organismi che formano il biofilm. Tuttavia, la conoscenza della resistenza agli antibiotici comparativa nei biofilm con o senza plasma è limitata.7,8

In questo studio, abbiamo confrontato le caratteristiche del biofilm S. aureus formato in presenza o assenza di plasma., L’analisi è stata effettuata su due ceppi di riferimento che erano rappresentanti di CA-MRSA e HA-MRSA, rispettivamente. Abbiamo applicato la microscopia a riflessione confocale a ottimizzazione continua (COCRM)9 per osservare le caratteristiche morfologiche del biofilm. COCRM ci ha permesso di osservare continuamente lo stesso biofilm senza aggiungere coloranti fluorescenti. Infine, la resistenza agli antibiotici è stata confrontata nei biofilm S. aureus formati con condizioni senza plasma e plasma aggiunto.,

Materiali e metodi

Ceppi batterici e condizioni di coltura

Due ceppi di MRSA, ATCC BAA1556 (ceppo FPR3757; clone USA300) e N315 (clone di New York / Giappone), sono stati utilizzati in questo studio.10,11 Questi ceppi sono stati conservati in Brain Heart Infusion (BHI) broth (Becton Dickinson) con 20% di glicerolo a -80°C. Prima dell’uso, i ceppi sono stati coltivati durante la notte su BHI agar e poi sottoculturati per 12 ore in brodo BHI a 35°C con agitazione a 160 rpm in condizioni aerobiche., Un millilitro della coltura è stato centrifugato a 9.000 × g e i pellet batterici sono stati sospesi in brodo di soia triptico (Becton Dickinson) contenente glucosio allo 0,25% (TSBG). Questo passaggio è stato ripetuto ancora una volta. Le concentrazioni inibitorie minime (MIC) di vancomicina, linezolid e rifampicina per entrambi i ceppi sono state rispettivamente di 0,5, 1 e 0,008 µg/mL. I MIC di daptomicina per BAA1556 e N315 erano 0,5 e 0,25 µg / mL, rispettivamente. I protocolli patogeni sono stati approvati dal Comitato di sicurezza dell’Università Toho per l’agente patogeno (approvazione n. 17-55-58).,

Quantificazione della formazione di biofilm nella piastra a 96 pozzetti utilizzando il metodo di colorazione crystal violet

Il plasma di coniglio (Eiken Chemical, Tokyo, Japan) è stato sciolto in TSBG e quindi diluito ulteriormente con TSBG. Le concentrazioni plasmatiche finali sono state aggiustate nell’intervallo 0-12, 5% (v/v). Le colture batteriche durante la notte sono state diluite a un OD600 di 0,01 (106-107 CFU/mL) utilizzando plasma contenente TSBG. Cento aliquote di microlitro sono state poi inoculate in singoli pozzetti di una lastra di polistirene a fondo tondo da 96 pozzetti e incubate a 35°C per 6-18 ore., Dopo l’incubazione, i biofilm sono stati quantificati seguendo un metodo di colorazione crystal violet precedentemente riportato, ad eccezione dell’uso di acido acetico al 33,3% invece di etanolo.12

Visualizzazione della struttura del biofilm in un piatto a base di vetro utilizzando COCRM

Le colture notturne sono state diluite a un OD600 di 0,01 utilizzando TSBG o TSBG contenente il 7,14% di plasma. Le aliquote di due millilitri sono state inoculate in piatti a base di vetro (IWAKI, Tokyo, Giappone) e incubate a 35°C per 12 o 24 ore., Dopo l’incubazione, i biofilm formati sulla superficie del vetro sono stati lavati con acqua e le strutture del biofilm sono state visualizzate da COCRM utilizzando un microscopio a scansione laser Carl Zeiss (LSM 710) dotato di una lente obiettivo plan-apocromatica con apertura numerica 63 × /1,40.I biofilm 9,13 e le superfici vetrate sono stati illuminati con laser argon 514 nm e la luce riflessa è stata raccolta attraverso un filtro passa-banda 505-530 nm. Come divisore del fascio, è stato utilizzato un mezzo specchio NT 80/20. Le immagini COCRM sono state analizzate con il software Carl Zeiss (ZEN 2011).,

Formazione di biofilm in un sistema a celle di flusso

Le celle di flusso (IBI Scientific, Dubuque, IA) sono state irrigate continuamente con terreno fresco (TSBG o TSBG contenente plasma allo 0,39%) utilizzando una pompa peristaltica (Ismatec, Glattbrugg, Svizzera).14 Le colture batteriche durante la notte sono state diluite a un OD600 di 0,01 utilizzando TSBG. Quattrocento aliquote di microlitro sono state quindi iniettate da ciascuno dei rubinetti a tre vie collegati alle estremità distali delle celle di flusso e coltivate per 1 ora a 35°C sulla superficie di vetro delle celle di flusso senza flusso., Dopo la conferma dell’adesione iniziale con COCRM, ogni mezzo scorreva ad una velocità di 0,2 mL / min. I biofilm sono stati incubati per 24 ore a 35°C. La formazione di biofilm è stata valutata dal COCRM ogni 3 ore.

Effetti dei cambiamenti medi sulla formazione di biofilm in un piatto a base di vetro

Abbiamo stabilito un protocollo simile al modello flow cell utilizzando piatti di vetro per analizzare l’attività antimicrobica contro il biofilm al plasma, perché il piatto di vetro è molto versatile per osservare la formazione di biofilm al plasma. Le colture notturne sono state diluite a un OD600 di 0,01 in TSBG o TSBG contenenti 0.,plasma al 78%. Aliquote di due millilitri sono state inoculate in piatti a base di vetro e incubate staticamente a 35 ° C in condizioni aerobiche per 1 ora per consentire l’adesione iniziale. Questo passaggio consente di osservare l’adesione dei batteri alla superficie del vetro mediante microscopia a riflessione confocale (CRM). Successivamente, i mezzi di coltura sono stati rinfrescati ogni ora per mantenere un apporto di plasma costante per 6 ore in totale. Il mezzo con plasma è stato sostituito cinque volte durante 6 ore (a 1, 2, 3, 4 e 5 ore)., Dopo l’incubazione, i biofilm formati sulla superficie del vetro sono stati lavati con acqua e le strutture del biofilm sono state visualizzate da COCRM.

Visualizzazione della penetrazione e dell’accumulo di antibiotici all’interno del biofilm utilizzando vancomicina e daptomicina marcate con fluorescenza

Le colture notturne sono state diluite a un OD600 di 0,01 in TSBG o TSBG contenente lo 0,78% di plasma. Aliquote di due millilitri sono state inoculate in piatti a base di vetro e incubate a 35°C. Durante 6 ore di incubazione, i terreni di coltura sono stati rinfrescati ogni ora., Dopo aver rimosso i batteri galleggianti lavando due volte con soluzione salina tampone fosfato (PBS), sono stati aggiunti antibiotici marcati con fluorescenza (BODIPY-FL-vancomicina o BODIPY-FL-daptomicina) ai piatti a base di vetro. BODIPY-FL-vancomicina è stato acquistato da Invitrogen, mentre BODIPY-FL-daptomicina è stato sintetizzato da BODIPY-FL estere NHS (Invitrogen) e daptomicina dalla Toho University School of Pharmaceutical Sciences. Entrambi gli antibiotici sono stati sciolti in dimetilsolfossido e poi diluiti con PBS con concentrazione di ioni calcio regolata a 50 mg / L., La concentrazione finale di BODIPY-FL-vancomicina aggiunta ai biofilm era di 2 µg / mL. Il BODIPY-FL-daptomicina sintetizzato ha mostrato una debole intensità di fluorescenza rispetto alla vancomicina, e quindi la concentrazione finale è stata regolata a 20 µg/mL. La permeabilità di entrambi gli antibiotici all’interno delle strutture del biofilm è stata monitorata per 60 minuti utilizzando un microscopio a scansione laser Carl Zeiss (LSM 710). I biofilm sono stati illuminati con laser argon a 488 nm e la luce riflessa è stata rilevata con un guadagno di 550., Allo stesso modo, i coloranti BODIPY-FL sono stati illuminati con laser argon a 488 nm e la fluorescenza verde è stata rilevata per vancomicina e daptomicina con un guadagno di 670 e 600, rispettivamente. Le immagini seriali sono state analizzate con un software Carl Zeiss (ZEN 2011).

Determinazione quantitativa del numero batterico vitale dopo l’esposizione agli antibiotici

Le colture overnight sono state diluite a un OD600 di 0,01 utilizzando TSBG o TSBG contenenti 0,78% di plasma. Le aliquote di due millilitri sono state inoculate in lastre di polistirene a sei pozzetti e incubate a 35°C., Durante 6 ore di incubazione, il mezzo di coltura è stato aggiornato ogni ora. Dopo la rimozione dei batteri galleggianti, i biofilm sono stati lavati due volte con TSBG e quindi trattati con 64 × MIC di antibiotici per 12 ore a 35 ° C. Questi antibiotici sono stati sciolti in TSBG con concentrazione di calcio regolata a 50 mg/L. Solo la rifampicina è stata sciolta in metanolo e quindi diluita con TSBG contenente 50 mg / L Ca2+. La concentrazione finale di metanolo era di 500 µL / mL. In questo esperimento, TSBG contenente 50 mg/L Ca2 + e metanolo sono stati utilizzati come controllo del brodo., I batteri galleggianti sono stati rimossi dopo il trattamento e i biofilm sono stati lavati due volte con soluzione salina. Due millilitri di proteinasi K (0,1 mg/mL; WAKO, Osaka, Giappone) disciolti in PBS sono stati utilizzati per allentare le strutture del biofilm. I biofilm trattati con proteinasi K sono stati staccati con un raschietto.15 Le sospensioni di biofilm sono state poste delicatamente a 37°C per 30 minuti e poi diluite con soluzione salina e placcate su agar nutritivo per contare il numero di batteri incorporati nel biofilm. Dopo la crescita a 35°C, le colonie sono state contate.

Saggio di vitalità batterica VIVO / MORTO

Colorazione di vitalità di S., aureus biofilm con o senza plasma dopo trattamenti con diversi agenti anti-MRSA è stato eseguito. Le colture notturne sono state diluite a un OD600 di 0,01 in TSBG o TSBG contenente lo 0,78% di plasma. Quindi, 200 ΜL di aliquote sono state inoculate in una camera a otto pozzetti (IWAKI) e incubate a 35°C. I supporti sono stati rinfrescati ogni ora per 6 ore. Dopo la rimozione dei batteri galleggianti, i biofilm sono stati lavati due volte con TSBG e quindi trattati con 64 × MIC di antibiotici per 12 ore a 35°C. Questi antibiotici sono stati sciolti in TSBG con concentrazione di Ca2 + regolata a 50 mg / L., La rifampicina è stata sciolta in metanolo e quindi diluita con TSBG contenente 50 mg/L. La concentrazione finale di metanolo era di 500 µL / mL. In questo esperimento, TSBG contenente 50 mg/L Ca2 + e metanolo sono stati utilizzati come controllo del brodo. I batteri galleggianti sono stati rimossi dopo il trattamento. La vitalità batterica nel biofilm è stata determinata dal kit di vitalità biofilm FilmTracer ™ LIVE/DEAD® (Molecular Probes). Le cellule vitali sono state macchiate con SYTO 9 (verde), mentre i batteri morti sono stati macchiati con ioduro di propidio (rosso)., Dopo il trattamento, i batteri sospesi sono stati rimossi e macchiati con soluzione di colorazione VIVA/MORTA per 20 minuti. Dopo la colorazione, il surnatante è stato rimosso e lavato due volte con acqua pura, quindi l’attività battericida dell’agente antibatterico è stata valutata visivamente mediante microscopio a scansione laser confocale.

Analisi statistica

I risultati analizzati utilizzando GraphPad Prism 5.0 sono presentati come valore medio ± deviazione standard. I risultati sono stati considerati statisticamente significativi quando il valore p era < 0.05., I risultati di esperimenti quantitativi eseguiti in fichi. 1 e 6 sono stati analizzati mediante analisi della varianza (ANOVA) con un test di Tukey.

Risultati

Effetti del plasma sulla formazione di S. aureus biofilm

Abbiamo esaminato la formazione di biofilm in varie concentrazioni di plasma per due ceppi di S., aureus, BAA1556 e N315. In entrambi i ceppi, la presenza di plasma anche a basse concentrazioni (0,09%) ha indotto un aumento della formazione di biofilm dopo 6 ore di incubazione (Fig. 1). Nel ceppo BAA1556, è stato osservato un aumento dipendente dalla concentrazione nella formazione di biofilm dal 3,12% plasmatico e una crescita sostanziale è stata osservata a 12 e 18 ore. Nel ceppo N315, è stato osservato un aumento più di tre volte della formazione di biofilm da 6 a 12 ore in assenza di plasma, senza alcuna differenza tra 0% e 0,09% plasma a 12 ore., Al contrario, è stata osservata una tendenza di riduzione graduale dipendente dalla concentrazione della massa del biofilm nel ceppo N315, da 0,78% o più alta concentrazione di plasma.

Caratteristiche morfologiche di S. aureus biofilm in presenza di plasma

S. aureus biofilm è stato formato su incubazione statica in presenza o assenza di plasma, e la microstruttura del biofilm è stata confrontata da COCRM. Come mostrato in Fig. 2, un biofilm uniforme e piatto è stato formato in assenza di plasma in entrambi i ceppi BAA1556 e N315., Al contrario, biofilm irregolare e strutturato in aggregato è stato osservato in presenza di plasma in entrambi i ceppi. La morfologia microscopica del biofilm di S. aureus formato in presenza di plasma era nettamente diversa da quelle formate senza plasma, e quindi, questi sono di seguito indicati come biofilm al plasma.

S. aureus formazione di biofilm in flow-cell condizione in presenza di plasma

Il flusso di cellule del sistema, che rappresenta una condizione clinicamente rilevante, è stato utilizzato per osservare l’effetto di continuo plasma di alimentazione sulla formazione di biofilm., Abbiamo confrontato i primi punti temporali della formazione di biofilm nella cella di flusso in presenza o assenza di plasma da parte di COCRM (Fig. 3). Senza plasma, l’attaccamento di pochi batteri è stato osservato dopo 3 ore di incubazione. Al contrario, sono stati osservati aggregati di formazione di biofilm in presenza di plasma in entrambi i ceppi di S. aureus. La struttura di questo biofilm al plasma dopo 3 ore nel sistema a celle di flusso era simile al biofilm al plasma in una condizione statica a 12 ore (Fig. 2)., Tuttavia, nella condizione di cella di flusso, il distacco del biofilm di plasma aggregato è stato osservato in punti temporali successivi di incubazione (dati non mostrati).

Penetrazione e accumulo di vancomicina nel biofilm S. aureus

I ceppi BAA1556 e N315 sono stati incubati in mezzo TSBG in presenza o assenza di plasma allo 0,78%. Il terreno di coltura è stato rinfrescato ogni ora per 6 ore. Nella condizione di controllo, la struttura del biofilm con o senza plasma è stata esaminata dal COCRM (Fig. 4-i). Quindi, la vancomicina verde marcata con fluorescenza è stata aggiunta alla coltura e il biofilm è stato osservato per un’ulteriore 1 ora., La penetrazione e l’accumulo di vancomicina sono stati confrontati in presenza o assenza di plasma mediante microscopia confocale a scansione laser. Come previsto, sono state osservate notevoli differenze nelle strutture del biofilm tra i campioni con o senza plasma. L’aggiunta di vancomicina fluorescente verde ha ulteriormente sottolineato le differenze tra i biofilm con o senza plasma. Nel biofilm privo di plasma, è stata osservata la distribuzione diffusa della fluorescenza verde in entrambi i ceppi., Al contrario, nel biofilm coltivato in presenza di plasma sono state osservate strutture ruvide sulla superficie, irregolarmente colorate con fluorescenza verde (Fig. 4-ii). Nel biofilm di S. aureus in condizioni prive di plasma, sono state osservate diffusione e forte fluorescenza verde 5 minuti dopo la somministrazione di vancomicina, che si è intensificata in momenti successivi. Al contrario, il biofilm al plasma ha mostrato diverse caratteristiche di colorazione in entrambi i ceppi di S. aureus., La fluorescenza verde è stata osservata debolmente nel biofilm plasmatico a 5 minuti, e successivamente l’accumulo di fluorescenza verde è aumentato gradualmente. Questi dati dimostrano un ritardo nella penetrazione e nell’accumulo di vancomicina nel biofilm plasmatico, rispetto al biofilm plasma-free (Fig. 4-iii).

Valutazione dell’accumulo di daptomicina in S. aureus biofilm nel tempo

Abbiamo usato la daptomicina verde con fluorescenza ed esaminato la penetrazione e l’accumulo di daptomicina in S. aureus biofilm. Poiché l’intensità della fluorescenza della daptomicina era più debole di quella della vancomicina, nell’esperimento è stata utilizzata una maggiore concentrazione di daptomicina., Nel biofilm formato in assenza di plasma, la fluorescenza verde era visibile da 10 a 20 minuti e, successivamente, l’intensità della fluorescenza aumentava in modo dipendente dal tempo per entrambi i ceppi di S. aureus. Al contrario, la fluorescenza verde era difficilmente rilevabile nel biofilm del plasma, anche dopo 60 minuti di incubazione (Fig. 5). Questi dati suggeriscono che ha ritardato la penetrazione e l’accumulo di daptomicina nel biofilm plasmatico, rispetto al biofilm plasma-free., Sfortunatamente, non abbiamo potuto confrontare i dati tra vancomicina e daptomicina, a causa delle differenze nelle intensità di fluorescenza verde degli antibiotici.

Effetto degli antibiotici sulla quantità batterica nel biofilm formato con o senza plasma

Abbiamo confrontato l’attività battericida degli antibiotici sul biofilm formato con o senza plasma. Prima del trattamento, conteggi cellulari batterici simili sono stati recuperati da biofilm plasma e plasma-free., Questo risultato suggerisce che la quantità di formazione di BF è aumentata proporzionalmente all’estensione dell’accumulo di componenti extracellulari, inclusa la proteina del fattore di coagulazione, ma indipendentemente dal numero di cellule batteriche aderenti. Anti-MRSA antibiotici vancomicina, daptomicina, o linezolid, con rifampicina ridotto numero batterico nel biofilm plasma-free. Tuttavia, i biofilm plasmatici di entrambi i ceppi di S. aureus erano generalmente più resistenti agli antibiotici, anche in combinazione con rifampicina., Per il ceppo BAA1556, nessuna condizione ha indotto più di due log riduzione del numero batterico, mentre il ceppo N315 ha mostrato una significativa riduzione del numero batterico nel biofilm plasmatico in presenza di rifampicina, vancomicina con rifampicina e daptomicina con rifampicina (Fig. 6). Questi risultati suggeriscono che i biofilm plasmatici sono più resistenti all’attività battericida degli antibiotici anti-MRSA esaminati. Abbiamo anche eseguito la colorazione della vitalità per differenziare le cellule vive e morte nei campioni di cui sopra., Alcuni risultati di colorazione erano coerenti con il numero batterico, ma c’erano diverse discrepanze tra la colorazione e la conta batterica (Fig. S1).

Discussione

Il metodo COCRM è stato, per la prima volta, applicato per l’osservazione del biofilm S. aureus, che ha mostrato la rapida crescita dei biofilm in presenza di plasma. La penetrazione o l’accumulo di antibiotici ritardati e la resistenza all’attività battericida degli agenti anti-MRSA sono stati osservati anche nei biofilm plasmatici., Questi risultati suggeriscono che il biofilm al plasma è sostanzialmente diverso morfologicamente e biologicamente dal biofilm privo di plasma.

Come mostrato in Fig. 1, la presenza di plasma ha migliorato la formazione di biofilm a 6 ore in entrambi i ceppi di S. aureus, anche ad una concentrazione minima di 0,09% plasma. In momenti successivi, la formazione di biofilm è stata migliorata per il ceppo BAA1556 in presenza di 3,12% o più di plasma, ma non per il ceppo N315. Al contrario, è stata osservata una tendenza alla riduzione della massa del biofilm per il ceppo N315 in concentrazioni plasmatiche più elevate., Poiché il metodo di colorazione crystal violet valuta l’attaccamento del biofilm ai pozzetti di micropiastre, è probabile che il distacco del biofilm e la nuova formazione di biofilm possano riflettere la massa totale del biofilm. Abbiamo quindi osservato la dispersione o il distacco del biofilm nel sistema flow-cell e attraverso l’incubazione statica, specialmente a concentrazioni più elevate di plasma in punti temporali successivi di incubazione (dati non mostrati).,

Nel sistema a celle di flusso osservato da COCRM, il biofilm aggregato è stato osservato entro 3 ore dall’incubazione, che era simile a 12 ore di incubazione del biofilm plasmatico in condizioni statiche. Una fornitura continua di plasma probabilmente imita più da vicino l’ambiente in vivo, che potrebbe accelerare la formazione di biofilm nel sistema a celle di flusso. COCRM è una tecnica di nuova concezione, 13 che ci ha permesso di osservare il corso temporale di maturazione e distacco dei biofilm senza l’utilizzo di coloranti fluorescenti., Pertanto, il COCRM potrebbe essere utilizzato come un potente strumento per analizzare il meccanismo di formazione del biofilm e per valutare potenziali strategie terapeutiche nella ricerca sul biofilm.

Abbiamo osservato differenze significative tra l’accumulo di vancomicina e daptomicina tra il plasma e il biofilm senza plasma. Jefferson et al. riferito che mentre vancomicina si lega ai batteri free-floating in acqua entro 5 minuti, ci sono voluti più di 1 ora per legare le cellule all’interno degli strati più profondi di un biofilm plasma-free.,16 In esperimenti di biofilm senza plasma, a concentrazioni terapeutiche di vancomicina, la matrice di biofilm non ha ostacolato la diffusione della vancomicina.17 Tuttavia, quando sono stati utilizzati pozzetti rivestiti di plasma umano, è stata osservata transitoriamente una maggiore suscettibilità al farmaco nella fase iniziale (≤24 ore), mentre i biofilm più vecchi e densi hanno mostrato un alto livello di resistenza in momenti successivi (>48 ore).6 Cardile et al. dimostrato che l’esposizione di S., aureus al plasma ha comportato un aumento significativo dei componenti di superficie microbica e i biofilm aumentati al plasma hanno mostrato una maggiore tolleranza alla vancomicina rispetto al biofilm coltivato in mezzi privi di plasma.7 Inoltre, nel modello murino delle infezioni da innesto vascolare protesico, la daptomicina era inefficace nell’eradicazione dei biofilm, poiché la matrice fungeva da scudo per la diffusione degli antibiotici.18 Questi risultati suggeriscono che S., la resistenza o la tolleranza correlata al biofilm di aureus agli agenti anti-MRSA potrebbe essere correlata a molteplici fattori, come la presenza di plasma, il tempo di incubazione, il cambiamento nella struttura superficiale batterica e le differenze di ceppo.

Abbiamo osservato una ridotta attività battericida con gli antibiotici anti-MRSA nel biofilm plasmatico, rispetto al biofilm plasma-free in entrambi i ceppi. Sebbene la quantità di formazione di biofilm sia aumentata in presenza di plasma, il numero di batteri non è aumentato., Si ritiene che l’aumento della formazione di biofilm ottenuto utilizzando componenti del plasma interferisca con l’attività dell’agente antimicrobico. Nel ceppo N315, l’aggiunta di rifampicina ha aumentato l’attività battericida di vancomicina e daptomicina, ma il suo effetto è stato scarso con il ceppo BAA1556. Sebbene il presente studio abbia esaminato due ceppi diversi, CA-MRSA (BAA1556) e HA-MRSA (N315), è necessario esaminare più ceppi per una migliore comprensione delle differenze di ceppo e dei meccanismi di resistenza e identificare combinazioni terapeutiche efficaci per il biofilm plasmatico.,

In questo studio, abbiamo usato il plasma di coniglio per analizzare il biofilm al plasma. Tuttavia, il plasma umano dovrebbe essere usato per chiarire il comportamento reale del biofilm del plasma nel corpo umano. Inoltre, il plasma è stato utilizzato in bassa concentrazione (0,39 − 7,14%) perché il plasma ad alta concentrazione causa la coagulazione del mezzo da parte della coagulasi da MRSA, che ostacola la valutazione del biofilm plasmatico. Tuttavia, un aumento significativo della quantità di formazione di biofilm è stato confermato in queste condizioni di ridotta proteina del fattore di coagulazione, rispetto al sangue., Un sistema di coagulazione potrebbe essere attivato in vivo, e quindi ulteriori studi per indagare condizioni più vicine al corpo umano sono necessari in futuro.

In conclusione, abbiamo riportato gli effetti del plasma sulla formazione di biofilm di CA-MRSA e HA-MRSA. I dati mostrano che il plasma è un fattore cruciale nel determinare non solo la massa del biofilm stesso, ma anche la natura biologica del biofilm, compresa la sensibilità alla penetrazione o all’accumulo di antibiotici e la resistenza ai farmaci anti-MRSA., Questi risultati sottolineano ulteriormente l’importanza dei biofilm plasmatici nella comprensione degli ostacoli associati all’eradicazione e al trattamento nelle impostazioni del letto. I biofilm plasmatici formati nel modello a cellule di flusso potrebbero rappresentare una condizione sperimentale clinicamente rilevante e l’applicazione del COCRM facilita ulteriori analisi dei meccanismi di formazione del biofilm e consente lo screening di nuove strategie per combattere le infezioni da MRSA.

Informativa

Non esistono interessi finanziari concorrenti.

Materiale supplementare

Figura supplementare S1