Etica approvazione, il consenso informato, luogo di studio
Tutte le procedure sono state approvate dalla University of Colorado Boulder Institutional Review Board. La natura, i benefici e i rischi dello studio sono stati spiegati a tutti i soggetti e il loro consenso informato scritto è stato ottenuto prima della partecipazione., Tutte le misurazioni sono state eseguite presso l’Università del Colorado Boulder Clinical & Translational Research Center (CTRC) e nel Integrative Physiology of Aging Laboratory. Lo studio è stato registrato su ClinicalTrials.gov sotto l’identificatore NCT02921659.
I partecipanti allo studio
Uomini di mezza età e anziani e donne in postmenopausa di età compresa tra 55 e 79 anni sono stati reclutati da Boulder Colorado e dalle comunità circostanti. Tutti i soggetti erano privi di patologie cliniche, inclusa la malattia delle arterie periferiche (indice caviglia-brachiale > 0.,90) e CVD palese come valutato da un test di esercizio graded, pannello di sangue basale, anamnesi ed esame fisico da un medico., Tutti i soggetti hanno dimostrato le disabilità legate all’età in vascular endothelial function (definito come un flow-mediated dilation valore <6%) e sono stati esclusi se esposto anormali di esami chimici del sangue renale o epatica (definito come 1 deviazione standard al di fuori del range di normalità), ha avuto dipendenza da alcool e incontrollata di malattie della tiroide, obesità grave (indice di massa corporea >40 kg m−2), o non erano di peso stabile per almeno 3 mesi prima dell’arruolamento nello studio (definito come >2 kg variazione di massa corporea)., La massa corporea, il BMI e le circonferenze della vita e dell’anca sono stati misurati mediante antropometria e la percentuale di grasso corporeo totale è stata misurata utilizzando l’assorbimetria a raggi X a doppia energia (Lunar/Prodigy, GE). Il glucosio a digiuno e i livelli di colesterolo totale, LDL e HDL sono stati misurati utilizzando saggi standardizzati presso il laboratorio core CTRC dell’Università del Colorado Boulder al basale e dopo ogni fase di intervento dello studio.
Progettazione, randomizzazione e intervento dello studio
Il progetto dello studio consisteva in uno studio clinico crossover randomizzato di 2 × 6 settimane, in doppio cieco, controllato con placebo., I soggetti hanno ingerito nicotinamide riboside cloruro (NIAGEN®; 500 mg, due volte al giorno; ChromaDex, Inc.) e capsule placebo per 6 settimane ciascuna in un ordine determinato casualmente. I soggetti sono stati randomizzati dopo aver fornito il consenso informato e aver soddisfatto tutti i criteri di inclusione. La randomizzazione è stata eseguita da un membro del team di studio non coinvolto nella valutazione dei risultati. I partecipanti allo studio e i membri del team di studio coinvolti nella raccolta e nell’analisi dei risultati sono stati accecati dalla condizione di trattamento. Le capsule sono state consumate con i pasti al mattino e alla sera., I soggetti si sono astenuti dall’assumere farmaci da banco per 48 h e farmaci da prescrizione per 24 h prima di tutti i test sperimentali. Tutte le valutazioni sono state eseguite dopo un digiuno notturno di 12 ore, ad eccezione dei test di funzionalità motoria, che sono stati eseguiti 2 ore dopo un pasto leggero o uno spuntino al fine di garantire che i soggetti avessero abbastanza energia per completare la batteria di test. I soggetti si sono astenuti dal consumo di alcol o dall’esercizio fisico vigoroso per 24 h e si sono astenuti dal prendere pillole di studio per almeno 12 h prima di tutte le sessioni di test.,
Valutazione della sicurezza e tollerabilità
L’aderenza all’intervento è stata valutata in base alla conta delle pillole. I soggetti hanno riferito al laboratorio ogni 2 settimane per ricevere un nuovo flacone di capsule e per discutere eventuali problemi con tollerabilità o AEs emergenti dal trattamento con un membro del team di ricerca che non è stato coinvolto nella raccolta o nell’analisi dei dati al fine di garantire l’accecamento degli investigatori., I marcatori clinici standard di ematologia, funzionalità epatica e renale e lipidi nel sangue sono stati analizzati utilizzando saggi clinici standardizzati presso il Boulder Community Hospital e qualsiasi risultato anomalo del sangue è stato esaminato dal medico dello studio.
Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico
Le PBMC sono state isolate da 35 ml di sangue intero raccolto in provette Vacutainer™ rivestite con EDTA. Il sangue è stato quindi centrifugato a 400 × g per 20 min e la maggior parte dello strato di plasma (~60%) è stato rimosso per aumentare l’efficienza dell’isolamento PBMC a valle., Il campione rimanente è stata aggiunta lentamente per un nuovo 50 ml conica provetta contenente 10 ml di Histopaque 1.077 (Greiner Bio-One) e cellule mononucleate strato è stato isolato da dipendente dalla densità centrifugazione a 400 × g per 20 min, lavato e poi congelato in 2 ml di PBS a -80°C.
Materiali
Preparazione di standard di calibrazione
i Singoli stock standard sono stati preparati sciogliendo 10 mg ml−1 a 1:1 metanolo:acqua e poi si combinano per ottenere un brodo di miscela., Lo stock combinato del metabolita NAD + è stato preparato a 100 µg ml−1 di ciascun composto e lo stock combinato nucleoside/nucleotide è stato preparato a 400 µg ml−1 di ciascun composto; entrambi sono stati congelati a -20 °C fino all’uso. La soluzione standard interna è stata preparata a 250 µg/ml adenosina-13C5, adenosina trifosfato-d4, riboside nicotinamide doppiamente marcato e 2,5 µg ml-1 di NaM-13C6 in 1:1 metanolo: acqua., Immediatamente prima dell’analisi di ciascun lotto di campione, sono stati preparati i singoli standard della curva di calibrazione combinando le scorte NAD+ e nucleoside/nucleotide in un rapporto di 1:1 e quindi diluendole in 1:1 metanolo:acqua alle concentrazioni richieste. Le concentrazioni variavano da 0,025 a 25 µg ml-1 per i metaboliti NAD+ e da 0,1 a 100 µg ml−1 per nucleosidi/nucleotidi. Le concentrazioni standard interne in tutti i livelli e campioni di taratura erano 50 µg ml-1 per adenosina-13C5, adenosina trifosfato−d4 e riboside nicotinamide doppiamente marcato e 0,5 µg ml-1 per NaM-13C6.,
Estrazione di metaboliti NAD+ e nucleosidi / nucleotidi
Le PBMC congelate (5×10E6 cellule totali) sono state scongelate su ghiaccio. 500 µl di ghiaccio freddo 70: 30 metanolo: acqua è stata aggiunta insieme a 20 µl di standard interno e campioni vortexati per 10 s. L’estratto risultante è stato centrifugato a 8000 × g per 5 min a 4 °C. Il surnatante risultante è stato trasferito in una nuova provetta da centrifuga e conservato su ghiaccio. Al pellet rimanente, sono stati aggiunti 500 µl di metanolo ghiacciato e il campione ha oscillato per 10 s per risospendere il pellet. Il campione è stato quindi centrifugato a 8000 × g per 5 min a 4 °C., L’intero surnatante è stato rimosso e combinato con il supernatante al 70% di metanolo. Il pellet risultante è stato riservato e congelato a -70 °C per l’analisi della concentrazione proteica utilizzando il test di Bradford. Il combinato supernatanti sono stati centrifugati a 18.000 × g per 15 min e la conseguente surnatante è stato trasferito in una nuova provetta e asciugato in un vuoto centrifugare a 55 °C. I campioni sono stati essiccati ricostituito in 100 µl di 1:1 metanolo:acqua e centrifugato a 18.000 × g per 10 min a 4 °C. Il surnatante è stato poi trasferito in una superficie ridotta attività autocampionatore flaconcino per l’analisi.,
LC-MS
La separazione HPLC di metaboliti NAD+ e nucleosidi / nucleotidi è stata eseguita utilizzando un metodo descritto da Evans et al.59 con piccole modifiche. La separazione dei metaboliti NAD+ e nucleosidi / nucleotidi è stata eseguita su un HPLC serie 1200 da Agilent (Santa Clara, CA) utilizzando una colonna Luna NH2 da 100 × 2 mm 5 µm da Phenomenex (Torrance, CA) operata in modalità HILICA. Il tampone A era costituito da acetonitrile al 100% e il tampone B era costituito da acqua 95:5 con acetato di ammonio da 20 mm regolato a pH 9,6 con idrossido di ammonio da 20 mm., Dieci microlitri del campione estratto sono stati analizzati utilizzando il seguente gradiente a una portata di 0,6 ml per min: gradiente lineare da 5 a 100% B su 6 min, tenere a 100% B da 6 a 9,5 min, quindi 100-5% B da 9,5 a 10,5 min, seguito da riequilibrazione a 5% B da 10,5 a 14 min. La temperatura della colonna è stata mantenuta a 15 °C per l’intero gradiente. L’analisi spettrometrica di massa è stata eseguita su uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo Agilent 6410 in modalità di ionizzazione positiva. Il gas di essiccazione era di 300 ° C ad una portata di 12 ml al min. La pressione del nebulizzatore era di 30 psi., La tensione capillare era di 4000 V. I dati per i metaboliti NAD+ e nucleosidi / nucleotidi sono stati acquisiti in modalità MRM utilizzando condizioni ottimizzate sperimentalmente ottenute mediante analisi di iniezione di flusso di standard autentici (Tabella supplementare 5). Gli standard di calibrazione sono stati analizzati in un intervallo di concentrazioni da 0,25 a 250 ng in colonna per i metaboliti NAD+ e da 1 a 1000 ng in colonna per nucleosidi/nucleotidi. Le curve di calibrazione per ciascun metabolita NAD+ e nucleoside / nucleotide sono state costruite utilizzando il software di analisi quantitativa Agilent Masshunter., I risultati per le PBMC sono stati quantificati utilizzando le curve di calibrazione per ottenere la concentrazione su colonna, seguita dalla normalizzazione dei risultati utilizzando la concentrazione proteica del pellet riservata dall’estrazione di PBMC.
Valutazioni della funzione cardiovascolare
La pressione sanguigna a riposo è stata misurata in posizione seduta dopo almeno 10 minuti di riposo tranquillo utilizzando un dispositivo semiautomatico per la pressione sanguigna (Dynamap™ XL, Johnson& Johnson, Arlington, TX, USA)., Le misurazioni sono state effettuate più volte dal braccio non dominante, con 2 minuti di riposo tranquillo tra le registrazioni. Sono state effettuate misurazioni ripetute fino a ottenere tre valori di pressione sanguigna entro 5 mmHg l’uno dall’altro. Questi valori sono stati poi mediati per determinare la pressione sistolica e diastolica a riposo e la pressione del polso. I valori basali della pressione arteriosa sono stati ottenuti utilizzando il protocollo sopra descritto in due giorni di test separati prima dell’inizio del braccio di primo intervento e sono stati calcolati in media per determinare lo stato basale della pressione arteriosa (cioè, normale vs., superiore al normale) per analisi successive.
La rigidità aortica è stata misurata utilizzando PWV carotide-femorale, la valutazione gold-standard della rigidità dell’arteria elastica negli umani38. Le forme d’onda di pressione sono state registrate simultaneamente dalle arterie carotidi e femorali utilizzando la tonometria di applanazione (Millar Inc., Houston,Texas) come precedentemente descritto dal nostro laboratory60,61, 62. Il tempo di transito dell’onda di impulso aortico è stato determinato misurando il tempo di ritardo tra il piede delle onde di pressione carotidea e femorale utilizzando il software di analisi LabChart., PWV è stato calcolato dividendo la distanza tra i due siti di misurazione per il tempo di transito aortico.
La conformità dell’arteria carotide è stata determinata dalla variazione del diametro dell’arteria carotide comune destra (valutata utilizzando l’ecografia ad alta risoluzione, PowerVision 6000, Toshiba) rispetto alla variazione della pressione arteriosa carotidea (valutata utilizzando la tonometria applanation, Millar Inc., Houston, TX) attraverso il ciclo cardiaco., La pressione carotidea è stata normalizzata alla pressione dell’arteria brachiale ottenuta utilizzando un bracciale di pressione sanguigna automatizzato (Dynamap™ XL, Johnson & Johnson, Arlington, TX, USA). La conformità è stata calcolata come CC = π × DD2 × (ΔD DD−1)/(2 × PP), dove DD è il diametro diastolico, ΔD è la variazione del diametro e PP è la pressione arteriosa del polso, come è stato descritto in precedenza62,63,64,65.,
La dilatazione dipendente dall’endotelio è stata misurata come dilatazione mediata dal flusso dell’arteria brachiale (FMD) in iperemia reattiva, utilizzando l’ecografia ad alta risoluzione (PowerVision 6000, Toshiba) come precedentemente descritto66,67,68. La FMD è stata espressa come variazione percentuale (%Δ) rispetto al diametro basale.
Le valutazioni della funzione metabolica
I record dietetici di tre giorni sono stati raccolti al basale e durante l’ultima settimana di ogni fase di intervento per garantire la stabilità dell’apporto calorico., I risultati sono stati analizzati da un dietologo registrato utilizzando il sistema di dati nutrizionali per la ricerca (Università del Minnesota) come precedentemente descritto dal nostro laboratorio67,69.
Il tasso metabolico a riposo è stato misurato mediante calorimetria indiretta (ParvoMedics TrueOne 2400) come descritto in precedenza dal nostro laboratorio70,71. I soggetti riposavano in posizione supina per 45-60 minuti con una cappa ventilata posta sopra la testa per raccogliere le concentrazioni di ossigeno scaduto (O2) e anidride carbonica (CO2)., Il tasso metabolico e il rapporto di scambio respiratorio (RER) sono stati calcolati in segmenti di 1 minuto e in media da almeno 30 minuti di dati stabili.
La sensibilità all’insulina è stata valutata misurando l’assorbimento di glucosio stimolato dall’insulina nel corpo intero utilizzando un test di tolleranza al glucosio per via endovenosa modificato frequentemente e il Metodo di analisi del Modello minimo come descritto in dettaglio altrove 72. La resistenza all’insulina e la sensibilità delle cellule beta sono state valutate utilizzando il metodo homeostasis model assessment (HOMA) come descritto in precedenza73.,
Le valutazioni della capacità di esercizio e della funzione fisica
L’idoneità cardiorespiratoria è stata determinata da un test di esercizio su tapis roulant graduato all’esaurimento volontario utilizzando un protocollo Balke modificato come descritto in precedenza74. Il consumo di ossigeno (VO2) e RER sono stati misurati utilizzando spirometria a circuito aperto con un sistema di analisi online assistito da computer. Anche la frequenza cardiaca e le valutazioni dello sforzo percepito (RPE) sono state misurate durante il test.,
La resistenza a piedi è stata valutata misurando la distanza percorsa durante un’attività di camminata di 6 minuti su un percorso indoor di 50 piedi (fuori e dietro) come descritto in precedenza75.
La forza muscolare e il tasso di sviluppo della coppia sono stati quantificati misurando la forza di picco prodotta durante una contrazione volontaria massima e il tasso di sviluppo della coppia è stato misurato utilizzando il tasso massimo di sviluppo della coppia durante una contrazione rapida e forte dei muscoli flessori ed estensori del ginocchio come precedentemente descritto dal nostro laboratorio76. La forza dell’impugnatura è stata misurata utilizzando un dinamometro standard.,
L’affaticamento delle gambe è stato valutato utilizzando le prestazioni fino al fallimento durante un’attività di sollevamento del tallone a gamba singola. Ai soggetti è stato chiesto di eseguire una contrazione completa della flessione plantare ogni 2 s fino al fallimento e il test è stato terminato quando il soggetto si è fermato volontariamente a causa del disagio o dell’incapacità di raggiungere almeno il 50% della flessione plantare massima senza utilizzare gli arti superiori per più di equilibrio77. Anche l’attributo cronico della fatica è stato valutato utilizzando un questionario sulla fatica e una scala di gravità della fatica 78.
L’equilibrio dinamico è stato valutato utilizzando un test rapid step., La lunghezza massima del passo è stata misurata in ogni direzione (avanti, indietro, sinistra, destra) e gli obiettivi sono stati posizionati a terra all ‘ 80% del massimo del soggetto con linee di nastro colorato, come descritto in precedenza79. Le prestazioni sono state quantificate come il tempo impiegato e il numero di errori commessi in media durante tre turni del test rapid step balance. Ogni round consisteva di 18 comandi che istruivano i soggetti a fare un passo con un piede casuale in una direzione casuale (cioè davanti a sinistra)., Un errore è stato definito come il mancato superamento del bersaglio, la perdita di equilibrio, il mancato ritorno alla posizione di partenza iniziale, l’adozione di più passaggi per raggiungere completamente un bersaglio, o il passo con la gamba errata o verso il bersaglio sbagliato.
La mobilità è stata valutata come il tempo necessario per completare un compito di camminata di 4 m (eseguito in duplicato alla velocità di camminata preferita dei soggetti) e il test sit-to-stand ripetuto di cinque volte (eseguito in triplice copia), come precedentemente descritto75,78,80., Il test consiste nel salire da una posizione seduta in una sedia di altezza standard cinque volte, il più rapidamente possibile, senza usare le braccia per lo slancio o il supporto.
La destrezza manuale è stata valutata come il tempo per completare un test pegboard a 9 fori come descritto in precedenza76. I soggetti raccoglievano pioli lisci e arrotondati da un piatto e li mettevano in un pegboard, quindi li restituivano al piatto il più rapidamente possibile. Due prove sono state completate con ogni mano.,
analisi Statistiche
La dimensione del campione di questo studio è stato sufficiente a rilevare almeno un 50% di aumento di NAD+ concentrazione seguenti NR supplementazione vs placebo (effetto size = 0.7; media di differenza = 7; 1−β = 0.8; α = 0.05), così come clinicamente rilevante miglioramento cardiovascolare parametro con il minor dimensione dell’effetto (afta epizootica; differenza media = >1%; effetto size = 0.86). La stima della dimensione dell’effetto per NAD+ è stata determinata dai dati preliminari delle concentrazioni dei metaboliti di NAD+ nelle PBMC raccolti in soggetti umani., La dimensione dell’effetto per la FMD è stata determinata dai precedenti interventi di crossover del nostro laboratorio che dimostrano miglioramenti nella funzione vascolare67. La dimensione del campione richiesto è stata determinata per essere 19 soggetti. Supponendo un abbandono del 20% (4 soggetti) e un’esclusione del 40% a causa di guasti allo schermo (coerente con altri studi di intervento nel nostro laboratorio utilizzando integratori dietetici81,82), un totale di partecipanti 60 è stato approvato per questo studio. La significatività è stata impostata su α = 0.006 per tutti i risultati secondari da regolare per test multipli di NR vs., placebo (t-test accoppiati) su ciascuna delle seguenti nove ipotesi pre-specificate: (1) metaboliti NAD+, (2) parametri cardiovascolari, (3) ematologia, (4) pannello metabolico, (5) profili lipidici, (6) bilancio energetico, (7) controllo glicemico, (8) funzione motoria e (9) prestazioni di esercizio. Poiché molte delle misure all’interno di ciascuna ipotesi sono correlate tra loro (ad esempio, misure cardiovascolari, Tabella supplementare 9), ciascun gruppo di misure sopra elencate è stato trattato come un risultato quando si è aggiustato per confronti multipli., Con l’eccezione delle nostre variabili di risultato primarie (NAD+ metaboliti: NAD+, NAAD, NADP, NaM, NMN), in cui le inferenze erano basate su un livello alfa non aggiustato impostato su 0.05, tutte le inferenze di significato sono basate sul livello alfa corretto da Bonferroni (α = 0.006).
L’intento di questo studio era quello di tradurre promettenti prove precliniche per l’efficacia della supplementazione cronica con NAD+ aumentando composti per l’uomo. Pertanto, ogni risultato è stato testato sotto un’ipotesi direzionale che è stata determinata a priori, sulla base di studi precedenti riportati in letteratura., Di conseguenza, sono stati utilizzati test di ipotesi a una coda per confrontare gli effetti unidirezionali proposti dalla supplementazione di NR rispetto al placebo su questi risultati. Questo metodo è stato raccomandato altrove per gli studi clinici controllati con placebo di fase I e II in cui l’obiettivo è ottenere una comprensione precoce della potenziale efficacia di un composto83.
Prima dell’analisi, tutte le variabili di risultato continuo sono state valutate per la normalità utilizzando il test Shapiro−Wilk e esaminando istogrammi di frequenza individuali per ciascun risultato., Se una variabile non era distribuita normalmente, veniva trasformata in log prima dell’analisi. Se la log-transformation non ha normalizzato i dati, la condizione di trattamento è stata analizzata utilizzando il test di rango firmato Wilcoxon non parametrico. Per ogni variabile, qualsiasi soggetto con un valore mancante durante entrambe le fasi è stato escluso da tale analisi. Sulla base dell’interpretazione dei dati primari, sono state eseguite analisi post-hoc per confrontare la variazione della pressione sanguigna e della rigidità aortica tra soggetti che mostravano una pressione sanguigna normale rispetto a quella basale normale utilizzando un test t a due code non accoppiato., Abbiamo anche esplorato la relazione tra le concentrazioni di NAD+ al basale e l’aumento complessivo di NAD+ utilizzando una correlazione di Pearson. Un periodo di washout formale non è stato incluso nel progetto dello studio; tuttavia, dato il progetto di crossover, abbiamo testato la presenza di un effetto di riporto per ciascuno dei risultati in studio utilizzando la regressione lineare modellata con un indicatore per l’ordine di trattamento (non sono stati osservati effetti di riporto tra le condizioni). Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando la R statistical computing platform (versione 3.2.2) e il software GraphPad Prism 7.
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