Denaturazione proteica mediante urea: Slash and bond

La stabilità delle pieghe native delle proteine globulari è piuttosto notevole, in quanto questa stabilità è marginale e limitata a una finestra relativamente stretta di condizioni termodinamiche e di composizione della soluzione (1)., Lo sviluppo di una profonda comprensione dell’equilibrio delle forze che fanno pendere la bilancia tra stati nativi e denaturati in termini di ruoli individuali di elettrostatica, interazioni idrofobiche, entropia polimerica, temperatura e pressione avrebbe un profondo impatto sulla nostra capacità di comprendere strutture native e stati aggregati anormali e aiuti nello sviluppo di sistemi bio-mimetici. Determinare come avviene lo spiegamento, cioè il percorso dinamico attraverso il quale viene stabilito lo stato denaturato, è ancora più impegnativo, ma può fornire informazioni sul panorama che governa il ripiegamento delle proteine (2)., Simulazioni precedenti che combinano stress da aumento della temperatura e denaturante cosolvent, urea, hanno seguito questa via per tempi brevi (3).

In questo numero di PNAS, Hua et al. (4) presentare i risultati di una simulazione di tour de force comprendente diverse simulazioni di microsecondi della dinamica del lisozima a temperatura ambiente in soluzione concentrata di urea, rivelando una via meccanicistica che isola l’impatto dell’urea sulla proteina che si sta svolgendo per la prima volta., In particolare, le simulazioni rivelano un processo graduale, a partire da uno stato che manifesta una solvatazione preferenziale dello stato globulare da parte dell’urea, rispetto all’acqua, determinata almeno in parte dalla maggiore attrazione di Van der Waals della proteina per l’urea. La perdita della struttura nativa si verifica con un’intrusione iniziale nella struttura terziaria prevalentemente da urea, seguita solo successivamente da una sostanziale idratazione, in contrasto con l’evidenza di idratazione iniziale durante la denaturazione dell’inibitore della chimotripsina 2 a temperature elevate (3)., Apprezzare le lezioni fornite da queste osservazioni richiede una certa riconciliazione con studi correlati sulle interazioni dell’urea con soluti più semplici in mezzi acquosi.

I principi alla base della destabilizzazione delle strutture proteiche piegate dall’urea acquosa sono stati discussi attivamente per decenni, con una letteratura troppo ampia per riassumere qui. Sebbene alcune delle prime discussioni del meccanismo si concentrassero sulla perturbazione della struttura dell’acqua di per sé (5), questo cosiddetto meccanismo “indiretto” non ha ricevuto molto sostegno da esperimenti (6) o simulazione (ref., 7 e riferimenti ivi) studi di urea acquosa. Tali studi implicano che l’urea sostituisca prontamente nella rete di legame idrogeno dell’acqua e che non vi sia alcuna segregazione dell’urea dall’acqua (6). Il meccanismo alternativo “diretto” implica un’interazione causale tra urea e polipeptide, una caratterizzazione chiaramente evidenziata nelle vie simulate (3, 4).

La capacità dell’urea di interagire sia con componenti non polari che polari delle proteine è stata riconosciuta fin dall’inizio come benefica per il potere di denaturazione (8)., Indagini sperimentali (9) e studi teorici (10-13) di sistemi modello più piccoli possono fornire indizi sugli elementi a scala molecolare nel contesto delle proteine. In questo contesto, sono stati presentati due punti di vista apparentemente diversi. Poiché l’urea agisce per migliorare la solubilità acquosa di tutti gli idrocarburi tranne i più piccoli (14), un’inferenza logica era che l’urea indeboliva l’interazione idrofobica, stabilizzando la solvatazione dello stato proteico spiegato in cui un maggior numero di catene laterali non polari sono esposte alla soluzione., La forza trainante per la solvatazione preferenziale del peptide da parte dell’urea derivante dalle interazioni di Van der Waals, identificata chiaramente nelle nuove simulazioni (4), arricchisce la disponibilità di urea per l’idratazione idrofobica. Il guadagno di entropia del solvente quando l’acqua inizialmente vincolata dall’idratazione idrofobica viene spostata dalla molecola di urea più grande (10, 11, 13) sembra anche migliorare questo effetto (13)., Studi separati (12) hanno fornito risultati che supportano una base prevalentemente elettrostatica per l’attività dell’urea e la destabilizzazione di un’elica polipeptidica da parte dell’urea acquosa è chiaramente correlata all’associazione preferenziale dell’urea con gruppi polari dorsali e catene laterali cariche. Un gruppo di simulazioni su larga scala di ciascuno dei 22 tri peptidi glycine-capped in soluzione acquosa di urea (11) ha fornito le preferenze di contatto tra gli atomi di ciascun residuo centrale e urea, rispetto all’acqua., Il risultato è che, ad eccezione dei residui con catene laterali cariche, l’urea è sempre preferita all’acqua. Questa preferenza aumenta monotonicamente con l’aumentare dell’idrofobicità della catena laterale; la spina dorsale attrae l’urea e le catene laterali idrofobiche aumentano questo effetto.

Tornando quindi al percorso di denaturazione così chiaramente visto in queste nuove simulazioni (4), ci si può chiedere come integrare questi vari studi accurati tra loro., In primo luogo, l’identificazione di un ruolo importante dell’attrazione di Van der Waals nella solvatazione preferenziale dei peptidi dell’urea (4) aiuta a spiegare la crescente preferenza dell’urea per catene laterali non polari sempre più grandi. Ancora più importante, perché l’urea domina l’acqua nella prima fase della penetrazione strutturale? Oltre alle interessanti interazioni appena menzionate, si sospetta il ruolo del confinamento. L’acqua liquida forma una rete tetraedrica di legame idrogeno 3D di riempimento spaziale (15) che è notevolmente adattabile alla presenza di intrusi sia idrofili che idrofobi”.,”Tuttavia, il confinamento in una dimensione ridotta è incompatibile con il soddisfacimento della rete, con costi entalpici ed entropici sostanziali, che in alcuni casi portano anche al congelamento a temperatura ambiente (16). L’urea può anche formare una struttura di rete, evidente nella sua forma cristallina ordinata e nei composti di clatrato non polare, ma in soluzione concentrata sembra formare facilmente catene e cluster (6). La capacità dimostrata di interagire preferenzialmente con i legami idrogeno della spina dorsale (12) aggiunge ancora una terza forza trainante per l’ingresso dell’urea nelle interfacce della piega proteica., Le tendenze iniziali portano in un tempo abbastanza breve ad uno stato spiegato (dopo 100 ns) che rivela chiaramente un miglioramento sostanziale nel contatto tra urea e acqua con catene laterali idrofobiche, e l’effetto è chiaramente migliorato quando il solvente o il cosolvente si legano all’idrogeno con la spina dorsale polare (4).

Le nuove simulazioni proteiche, combinate con i precedenti studi di sistemi modello, forniscono un quadro chiaro dell’attività dell’urea sia sulla termodinamica degli stati nativi e denaturati che lungo il percorso tra di essi., Appare chiaro che la capacità dell’urea acquosa di agire come solvente per entrambi i gruppi non polari e polari svolge un ruolo vitale. È la qualità critica che determina il percorso graduale dell’urea. La penetrazione di una molecola come l’urea, che ha un’affinità per la solvatazione polare e non polare, nelle interfacce interne della proteina è facilmente compresa dalla visualizzazione di un prototipo. In Fig. 1, un’interfaccia tra le eliche in un particolare nucleo proteico piegato è mostrata con una mappa dei potenziali elettrostatici superficiali., Come è evidente in questa mappa, c’è una notevole polarità presente a tali interfacce, anche se normalmente sono assegnate un’origine principalmente idrofobica. La propensione a un significativo potenziale elettrostatico positivo negli interni proteici è stata identificata come tipica di una varietà di motivi di piega (18). Vale la pena sottolineare che l’evidenza collettiva mostra che tutte le componenti chiave delle forze intermolecolari (attrazione di Van der Waals, elettrostatica, legame idrogeno e interazioni idrofobiche) svolgono un ruolo significativo nella creazione di queste affinità relative., Corrispondentemente, si deve rimanere un po ‘ scettici nei calcoli quantitativi basati sui potenziali del modello quando si opera in domini termodinamici e di composizione inesplorati.

È di grande interesse chiedere la capacità di generalizzare il meccanismo di denaturazione dell’urea. Ad esempio, approcci importanti allo studio della dinamica di ripiegamento delle proteine sono iniziati da stati ottenuti da varie condizioni di denaturazione (19)., In che modo questi stati iniziali sono potenzialmente diversi? Lo den guanidinio denatura sostanzialmente con lo stesso meccanismo e via dell’urea? I risultati della simulazione mostrano che questo cosolvente ionico ha un effetto più drammatico sull’interazione tra soluti carichi rispetto all’urea (12). Studi strutturali sperimentali dimostrano che lo ion guanidinio è estremamente debolmente idratato (9), in modo che questo bulky ingombrante potrebbe anche associarsi a superfici idrofobiche (9, 12). Una domanda più sottile è la relazione tra la denaturazione dell’urea e gli effetti” indiretti ” della pressione e della temperatura., Esiste un confronto razionale su scala molecolare o termodinamico tra la solvatazione di gruppi non polari e polari in acqua fredda o ad alta pressione e in soluzioni denaturanti, e esiste una stretta analogia strutturale nelle vie di denaturazione? È stato sostenuto che la denaturazione indotta dal freddo e dalla pressione dovrebbe essere vista come la penetrazione dell’acqua in domini idrofobici, piuttosto che in termini di solubilità degli idrofobi in acqua liquida (20), quindi non è uno sforzo di immaginazione credere che ci siano connessioni da fare., Quando due o più perturbazioni sono combinate, come la denaturazione indotta dall’urea con un riscaldamento modesto, quanto sono simili i percorsi e gli stati finali a cui si accede? Il confronto dei risultati finora (3, 4) suggerisce che i percorsi sono diversi. Con gli evidenti passi avanti compiuti nei processi che possono essere simulati e misurati sulla stessa lunghezza e scale temporali, non dovremmo aspettare troppo a lungo per imparare le risposte a queste domande.