Scoperta del DNA mitocondriale

Alcuni concetti prendono d’assalto il mondo scientifico, ma altri lo conquistano solo dopo molte schermaglie. La scoperta del DNA mitocondriale (mtDNA) appartiene a questa seconda categoria. Biochimici, istologi e microscopisti elettronici avevano visto il DNA nei mitocondri per anni, ma la maggior parte di loro non erano pronti per l’idea che il DNA appartenesse davvero lì. Questo potrebbe spiegare perché i conti dei libri di testo di mtDNA non dicono quasi mai come questo DNA è stato scoperto.,

Dopo che il piano di costruzione di base della cellula eucariotica era stato rivelato nei primi anni 1950 dai micrografi elettronici di Palade, Sjöstrand e altri, i biochimici abbracciarono il dogma di de Duve che ogni macromolecola aveva una, e solo una, posizione intracellulare. Nell’analisi delle frazioni cellulari, la citocromo ossidasi è stata presa come marker per i mitocondri, nicotianamide adenina dinucleotide fosfato (NADPH)–citocromo c reduttasi per il reticolo endoplasmatico e DNA per il nucleo., Dato questo stato d’animo, è facile capire perché la presenza di DNA nelle frazioni mitocondriali è stata generalmente attribuita alla contaminazione da frammenti nucleari. Le macchie di DNA istochimico, come la reazione di Feulgen, hanno anche macchiato i cinetoplasti dei Tripanosomi e il “Nebenkern” degli spermatozoi degli insetti, ma a quel tempo non era ancora riconosciuto che queste strutture fossero, in realtà, mitocondri insoliti., Enormi quantità di DNA extranucleare sono state rilevate anche nel citoplasma degli ovociti anfibi, ma ci sono voluti molti anni per rendersi conto che questo DNA era, in realtà, mtDNA la cui abbondanza rifletteva l’enorme quantità di mitocondri in queste grandi cellule. Nel 1961, al quinto incontro annuale dell’American Society of Cell Biology di Chicago, Hans Ris mostrò micrografie elettroniche di mitocondri con inclusioni simili ai nucleoidi contenenti DNA dei batteri e fece la proposta eretica che i mitocondri (e anche i cloroplasti) contengono il proprio DNA., In un documento che è apparso l ” anno successivo, Ris e Walter S Plaut ulteriormente documentato e ampliato queste osservazioni. Poco dopo, prove biochimiche e morfologiche di diversi gruppi hanno confermato la presenza di DNA nei cloroplasti.

La scoperta del DNA del cloroplasto ha fatto sì che i biochimici prendessero una nuova occhiata alle prime scoperte di Margaret Mitchell e Boris Ephrussi secondo cui alcune mutazioni che influenzano la funzione mitocondriale nella muffa Neurospora crassa e nel lievito Saccharomyces cerevisiae non erano ereditate secondo le leggi di Mendel., Sembrava allettante ipotizzare che i “fattori extracromosomiali” sconosciuti implicati in queste mutazioni fossero, in realtà, mtDNA.

Nel 1962, il terreno per il concetto di mtDNA era quindi ben preparato, ma il concetto stesso non era generalmente accettato. In retrospettiva, sembra che la comunità scientifica stesse aspettando studi convincenti che documentassero l’esistenza di mtDNA con diversi metodi.

Uno di questi studi proveniva dai microscopisti elettronici Margit MK Nass e Sylvan Nass, che lavoravano allora all’Istituto Wenner Gren dell’Università di Stoccolma., Essi hanno dimostrato che la matrice di osmio-fisso embrione di pulcino mitocondri contenuti thread-come inclusioni, il cui aspetto dopo diverse procedure di fissazione strettamente parallelo che di istone-free DNA nucleoide di batteri: dopo il fissaggio con tetrossido d’osmio, inclusioni apparso a blocchi di colore e bar con un diametro di ~400 Å; fissazione dei tessuti con tetrossido d’osmio seguita da un trattamento con acetato di uranile prima di disidratazione li ha fatti apparire come 15-30-Å fibre sottili., Una prova ancora più convincente della presenza di DNA in queste inclusioni è stata l’osservazione che le inclusioni potevano essere rimosse trattando il tessuto embrionale leggermente fissato con DNasi. Il trattamento con pepsina, con RNasi o con controlli tampone privi di DNasi era inefficace. La chiarezza di questi micrografi elettronici e gli accurati controlli che sono stati inclusi hanno avuto un impatto convincente sui biologi cellulari. MMK Nass e S Nass hanno pubblicato il loro lavoro in due documenti back-to-back in un numero del 1963 del Journal of Cell Biology., A quel tempo, tuttavia, la biologia cellulare e la biochimica erano ancora discipline piuttosto diverse e la maggior parte dei biochimici non esaminava riviste dedicate alla biologia cellulare. Ci è voluto quindi un po ‘ prima che i risultati di MMK Nass e S Nass entrassero nella coscienza della comunità biochimica.

All’incirca nello stesso periodo, Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy e Schatz presso l’Istituto di biochimica dell’Università di Vienna stavano cercando di trovare una base biochimica per le mutazioni extracromosomiali che abolivano la funzione respiratoria nel lievito S. cerevisiae., Nei primi anni 1960, molti biochimici erano ancora riluttanti a considerare i “granuli respiratori” del lievito come mitocondri in buona fede, che hanno posto la ricerca di Haslbrunner et al. ben al di fuori del mainstream della biochimica mitocondriale negli Stati Uniti e altrove.

Per cercare il DNA nei mitocondri, è stato scelto un approccio biochimico. I mitocondri del lievito sono stati purificati con i migliori metodi disponibili e il loro contenuto di DNA è stato misurato dalla reazione di colore “Diesche”, rispettata dal tempo., Alcuni anni prima, de Duve e colleghi avevano dimostrato che la centrifugazione delle frazioni subcellulari all’equilibrio in un gradiente di densità spesso dava una separazione pulita di diversi organelli. Sorprendentemente, il solito gradiente di saccarosio non ha separato lievito mitocondri nucleare frammenti, ma quando il saccarosio è stato sostituito con l’X-ray a contrasto agente ‘Urografin’, i mitocondri formata un’immagine estremamente nitida band, e il DNA è presente solo in due frazioni: la maggior parte era sul fondo della provetta, e in quantità molto piccole, ma discreto picco coincide esattamente con quella dei mitocondri., Il DNA nella frazione inferiore era facilmente digeribile dalla DNasi e apparentemente rappresentava il DNA nucleare. Il DNA nella frazione mitocondriale non è stato facilmente digerito dalla DNasi a meno che gli organelli non siano stati prima interrotti con acido tricloroacetico; presumibilmente, rappresentava il DNA racchiuso dalle membrane mitocondriali. La sua concentrazione era molto costante tra diversi esperimenti – tra 1 e 4 µg mg−1 proteina mitocondriale. Urografin-mitocondri purificati da fegato di ratto, rene di ratto e cuore bovino – contenevano quasi 10 volte meno DNA, tra 0,2 e 0,6 µg di DNA per proteina mg., Il mitocondrio tipico dei mammiferi è stato calcolato per contenere 3 × 10-17 g di DNA. Supponendo che il DNA fosse a doppio filamento, potrebbe codificare non più di 1,2 MDa di catene polipeptidiche. Questo risultato è stato considerato importante, perché ha escluso fermamente la possibilità che mtDNA codificasse tutte le proteine mitocondriali. Oggi, questo primo calcolo da Haslbrunner et al. potrebbe essere sfidato per diversi motivi, ma è venuto notevolmente vicino alla realtà: i 13 polipeptidi codificati da mtDNA mammifero hanno una massa totale di 0.,423 MDa, e il resto del potenziale di codifica è in gran parte rappresentato dai geni per gli RNA ribosomiali e di trasferimento, nonché dal fatto che i mitocondri di solito hanno più di una copia del loro genoma del DNA.