ENZIMI INDUSTRIALI: MICROBI CHE PRODUCONO LIPASI DA SOSTANZE VOLATILI DI SCARTO
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ENZIMI INDUSTRIALI: MICROBI CHE PRODUCONO LIPASI DA SOSTANZE VOLATILI DI SCARTO
- M. Muthumari, S. Thilagavathi e N., Hariram *
Dipartimento di Biotecnologia, Kalasalingam University, Krishnankoil-626126, Tamil Nadu, India
ABSTRACT: La lipasi è un importante enzima termostabile extracellulare che ha ricevuto una notevole attenzione per il potenziale utilizzo nell’industria alimentare. Quindi per raggiungere la produzione su larga scala di organismo gram positivo e negativo è commercialmente importante enzima lipasi sotto la fermentazione. Le lipasi sono prodotte da microrganismi come batteri e funghi. Tuttavia, ci siamo concentrati sulle lipasi microbiche batteriche erano economicamente importanza di diverse proprietà., Gli attuali studi sugli obiettivi di questo documento erano l’isolamento e l’identificazione dei batteri produttori di lipasi da sostanze volatili di scarto delle centrali elettriche che producono biogas come fonti. È stata eseguita l’ottimizzazione delle condizioni sperimentali per la massima quantità di produzione enzimatica.
Parole chiave:
Lipasi, Enzima, Gram positivi, Gram negativi e batteri
INTRODUZIONE: Le lipasi (triacilglicerolo acil idrolasi, EC 3.1.1.3) catalizzano l’idrolisi e la sintesi di esteri formati da glicerolo e acidi grassi a catena lunga., Le lipasi si verificano ampiamente in natura, ma solo le lipasi microbiche sono commercialmente significative. Le molte applicazioni delle lipasi includono sintesi organiche speciali, idrolisi di grassi e oli, modifica dei grassi, miglioramento del sapore nella lavorazione degli alimenti, risoluzione delle miscele racemiche e analisi chimiche. Questo articolo discute la produzione, il recupero e l’uso delle lipasi microbiche. I problemi di cinetica enzimatica, termostabilità e bioattività sono affrontati e anche le produzioni di lipasi ricombinanti sono dettagliate. Vengono discussi preparati immobilizzati di lipasi., In considerazione della crescente comprensione delle lipasi e delle loro numerose applicazioni in sintesi di alto valore e come enzimi sfusi, questi enzimi stanno avendo un impatto crescente sul bioprocessing
Ci devono essere tre fattori per rilevare un batterio lipasi-positivo coltivandolo. Questi fattori includono (i) la crescita dell’organismo, (ii) la produzione di lipasi da parte di tale organismo in condizioni di crescita adeguate e (iii) la presenza di un metodo sensibile per rilevare l’attività della lipasi 31. Le condizioni di crescita influenzano la sintesi della lipasi da parte dei microrganismi., Fonti di carbonio e azoto, la presenza di attivatori e inibitori, temperatura di incubazione, pH, quantità di inoculo e tensione di ossigeno possono influenzare la produzione di lipasi 13. La fonte di carbonio è stata riportata come il principale fattore che influenza l’espressione della lipasi, poiché le lipasi sono enzimi inducibili. La produzione di questi enzimi dipende dalla presenza di un lipide, come l’olio d’oliva o qualsiasi altro induttore, come triacilgliceroli, acidi grassi e interpolazioni.,
Negli eucarioti, le lipasi sono coinvolte in varie fasi del metabolismo lipidico, tra cui la digestione dei grassi, l’assorbimento, la ricostituzione e il metabolismo delle lipoproteine. Nelle piante, le lipasi si trovano nei tessuti di riserva energetica. Il modo in cui lipasi e lipidi interagiscono all’interfaccia non è ancora del tutto chiaro ed è oggetto di intense indagini 3. A causa del loro ampio significato, le lipasi rimangono oggetto di studio intensivo., La ricerca sulle lipasi è focalizzata in particolare sulla caratterizzazione strutturale, delucidazione del meccanismo d’azione, cinetica, sequenziamento e clonazione dei geni lipasi e caratterizzazione generale delle prestazioni 1, 4. In confronto a questo sforzo, relativamente poco lavoro è stato fatto sullo sviluppo dei sistemi robusti del bioreattore della lipasi per uso commerciale.
Le lipasi commercialmente utili sono solitamente ottenute da microrganismi che producono un’ampia varietà di lipasi extracellulari., Molte lipasi sono attive nei solventi organici dove catalizzano una serie di reazioni utili tra cui l’esterificazione 8, 16, 21, 23, 24, 25, 30 transesterificazione, acilazione regioselettiva di glicoli e mentoli e sintesi di peptidi 10, 39 e altre sostanze chimiche1, 4, 5.
MATERIALI E METODI:
Raccolta dei campioni:
Le sostanze volatili sono state raccolte in sacchetti di plastica dallo stabilimento IOT di Pudhuchathiram e Tiruchencode a Tamilnadu, in India., L’isolamento dell’isolato batterico è stato effettuato diluendo in serie i campioni volatili in acqua sterile e successivamente placcando sul terreno di base di agar tributirina 1,5% contenente Rodomina B utilizzando il metodo pour plate.
Effetto del pH iniziale:
L’effetto del pH iniziale è stato raggiunto nell’intervallo da 5,0 a 8,0 producendo lipasi utilizzando colture di beuta. Il mezzo contenente 0.5% di olio d’oliva e con Tween 20 indurre l’attività lipolitica è stata aumentata.,
Effetto della temperatura:
L’effetto di diversi tipi di temperatura sono stati incubati nella piastra batterica dalla produzione di lipasi è stato testato in 37ºC, 50ºC e 70ºC mantenendo costante il pH del mezzo di fermentazione insieme alla concentrazione ottimale di 0.5% di olio d’oliva e con 20.
Analisi della lipasi:
Per determinare l’attività della lipasi sulla base dell’idrolisi dell’olio d’oliva 28. Il campione è stato miscelato con 1,0 ml di substrato contenente 10,0 ml di olio d’oliva omogeneizzato al 10% in gomma arabica al 10% (Neem), 2 ml di 0,6% di soluzione CaCl2 e 5 ml di 0.,2mol l1 citrato buffer, pH7.0. La miscela di substrato enzimatico è stata incubata su uno shaker orbitale a 100rpm a 37ºC per 1 ora. Per fermare la miscela di reazione, gli acidi grassi liberati sono stati titolati con 0,1 mol l-1NaOH. L’attività enzimatica della lipasi extracellulare è stata espressa in unità (U) per ml di brodo.
RISULTATI E DISCUSSIONE:
Isolamento e identificazione dei ceppi batterici produttori di lipasi:
Le sostanze volatili sono state raccolte in sacchetti di plastica dallo stabilimento IOT di Pudhuchathiram e Tiruchencode a Tamilnadu, in India., L’isolamento dell’isolato batterico è stato effettuato diluendo in serie i campioni volatili in acqua sterile e successivamente placcando sul terreno di base di agar tributirina 1,5% contenente con e senza rodomina B utilizzando il metodo pour plate (Fig.3). Le piastre sono state incubate a 37’Cfor 48-72hrs. e osservare per la formazione di zone(Fig.4). Una zona chiara intorno alle colonie indica la produzione di lipasi (Cardenas et al, 2001)., I ceppi lipasi positivi sono stati ulteriormente purificati, coltivati in brodo nutriente a 37’C per 24 ore e sottoposti a screening per la capacità di produrre lipasi con olio d’oliva, gli isolati batterici L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10 e L11. Tra questi, è stata identificata la più alta attività lipasica per temperatura diversa e il pH (Fig 1 e 2) e ulteriori studi sono stati effettuati con caratteristiche morfologiche, fisiologiche e biochimiche (Tabella 1) dei potenti ceppi lipolitici selvatici sono stati determinati con il metodo descritto nel “Manuale di Batteriologia determinativa di Berget”.,
PIASTRA 2: A-F. MOSTRA LIPASI PRODUCENDO DIVERSI TIPI DI ISOLATI.
FIG. 3: MOSTRA LA SUPPLEMENTAZIONE DI TERRENO DI AGAR TRIBUTIRINA CON RODOMINA B E DIVERSA MORFOLOGIA DELLA COLONIA DI LIPASI PRODUCENDO ISOLATI.
FIG.4: MOSTRA LA SUPPLEMENTAZIONE DI TERRENO DI AGAR TRIBUTIRINA CONTENENTE L1 A L11 DIVERSA MORFOLOGIA DELLA COLONIA DI LIPASI PRODUCENDO ISOLATI E FORMAZIONE DI ZONA NELLA PIASTRA (48HRS).
Effetto delle fonti di carbonio:
Sugihara et al.,(1991) ha riportato la produzione di lipasi da isolati batterici in presenza di olio d’oliva 1% nel terreno di coltura. Poca attività enzimatica è stata osservata in assenza di olio d’oliva anche dopo una coltivazione prolungata. Glucosio, olio d’oliva e Tween 20 sono stati segnalati come le migliori fonti di carboidrati e lipidi, rispettivamente, per la produzione di una lipasi extracellulare da parte degli isolati batterici L1, L3, L4, L6, L7, L9, L10 e L11. Quando le due fonti di carbonio sono state confrontate, l’olio di palma a una concentrazione di 2% ha prodotto 12 volte più lipasi rispetto al mezzo di fruttosio 29.,
TABELLA 1: CARATTERI MORFOLOGICI, FISIOLOGICI E BIOCHIMICI DELL’ORGANISMO PRODUTTORE DI LIPASI DA SOSTANZE VOLATILI.
Effetto del pH e della temperatura:
L’enzima ha mostrato un’attività ottimale a 50ºC e pH7.0. L’attività enzimatica massima 7.5 U / ml a 8.5 pH è stata trovata in L5 isolato e confrontare con L4 isolato è stato trovato poco meno in 0.8 U/ml di attività. Al contrario, se l’aumento della temperatura a 70ºC l’attività enzimatica è stata trovata alta in 7U/ml a L4 isolato e meno in resa L5 a 2,5 U/ml di sintesi enzimatica., Allo stesso modo i nostri risultati sono stati trovati nell’enzima mantenuto 50% della sua attività originale dopo 1-h incubazione a 60ºC e 30-min incubazione a 70ºC 26.
Microrganismi che producono lipasi:
Le lipasi sono prodotte da molti microrganismi e da eucarioti superiori. La maggior parte delle lipasi commercialmente utili sono di origine microbica. Alcuni dei microrganismi che producono lipasi da sostanze volatili sono elencati nella Tabella 1.,
Isolamento e screening dei microrganismi produttori di lipasi:
I microrganismi produttori di lipasi sono stati trovati in diversi habitat come i rifiuti volatili industriali degli isolati batterici L1, L2, L3,L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10 e L11., fabbriche di lavorazione dell’olio vegetale, caseifici, terreno contaminato da olio, semi oleosi e cibo in decomposizione 36, cumuli di compost, punte di carbone e sorgenti calde 37. Tuttavia, i microrganismi che producono lipasi includono batteri, funghi, lieviti e actinomyces., Metodi semplici e affidabili per rilevare l’attività della lipasi nei microrganismi sono stati descritti da Sierra(1957). Le formazioni di zone opache intorno alle colonie sono un’indicazione della produzione di lipasi da parte degli organismi. La modifica di questo come dice usa i vari tensioattivi di Tween congiuntamente all’olio del piede del nilo blueorneet ed ai sali di Cu2+. Inoltre, lo screening dei produttori di lipasi su piastre di agar viene spesso eseguito utilizzando Tributirina come substrato 7 e le zone chiare intorno alle colonie indicano la produzione di lipasi., Sono stati descritti anche sistemi di screening che utilizzano substrati cromogenici 38. Wang et al. (1995) piastre utilizzate di un’attività lipasi rodamina Bagartoscreen modificata in un gran numero di microrganismi. Altre versioni di questo metodo sono stati segnalati 17, 22.
Tipi di mediaper lo sviluppo della lipasi:
Le lipasi sono prodotte principalmente da microrganismi per coltura sommersa 18, ma possono essere utilizzati anche metodi di fermentazione allo stato solido 9. La coltura cellulare immobilizzata è stata utilizzata in alcuni casi15., Molti studi sono stati intrapresi per definire la coltura ottimale e i requisiti nutrizionali per la produzione di lipasi per coltura sommersa. La produzione di lipasi batterica enzimatica è influenzata dal tipo e dalla concentrazione di fonti di carbonio e azoto, dal pH della coltura, dalla temperatura di crescita e dalla concentrazione di ossigeno disciolto 11. Le fonti di carbonio lipidico sembrano essere generalmente essenziali per ottenere un’alta resa di lipasi; tuttavia, alcuni autori hanno prodotto buone rese in assenza di grassi e oli.,
Applicazione industriale:
Le lipasi sono considerate il terzo gruppo enzimatico più grande, dopo le proteasi e le carboidrolasi, in base al volume totale delle vendite. L’uso commerciale delle lipasi è un business da miliardi di dollari che consiste in un’ampia varietà di applicazioni diverse (Tabella 2). Gli enzimi lipolitici stanno attualmente attirando un’enorme attenzione a causa del loro potenziale biotecnologico 12, 19, 27, 32. Le lipasi sono utilizzate in due modi distinti: come catalizzatori biologici per la produzione di prodotti diversi (ad es., ingredienti alimentari) e in applicazioni dirette, come sgrassanti nell’industria della lavorazione del cuoio, additivi per la formulazione di detersivi per bucato o come potenziale idrolizzazione
TABELLA 2: APPLICAZIONE INDUSTRIALE E FUNZIONE DEGLI ENZIMI BATTERICI LIPASI
S.,2″>VII | Paper | Improved quality | Bacteria | Hydrolysis | Paper |
VIII | Cleaning | Removal of fats | Bacteria | Hydrolysis | Cleaning |
agents for industrially important fats and oils., Lipasi scan essere utilizzato anche in esterificazione, transesterificazione e interesterificationreactions14, 20. La transesterificazione catalizzata dalla lipasi nei solventi organici è un’applicazione industriale emergente, come la produzione di equivalente burro di cacao, sostituto grasso del latte umano, acidi grassi polinsaturi farmacologicamente molto importanti, lipidi ricchi o ipocalorici e produzione di biodiesel da olio vegetale 19. Le lipasi sono anche utilizzate come detersivo per bucato e componenti detergenti per il lavaggio dei piatti., Possono ridurre il carico ambientale dei prodotti detergenti, poiché risparmiano energia consentendo una temperatura di lavaggio più bassa e sono biodegradabili, senza lasciare residui dannosi. Ci sono molti brevetti disponibili della lipasi e prodotti commerciali per l’industria detergente 14. Le lipasi sono ampiamente utilizzate nell’industria casearia per l’idrolisi del grasso del latte. Le applicazioni attuali includono il miglioramento del sapore dei formaggi, l’accelerazione della maturazione dei formaggi e la lipolisi del grasso e della crema di burro., Gli acidi grassi liberi generati dall’azione delle lipasi sul grasso del latte sono essenziali per molti prodotti lattiero-caseari, in particolare per ammorbidire i formaggi, poiché questi hanno caratteristiche di sapore specifice6,14.
CONCLUSIONE: Le lipasi sono enzimi versatili che sono ampiamente utilizzati e stanno diventando sempre più importanti in applicazioni di alto valore nell’industria alimentare e nella produzione di prodotti chimici fini. Le lipasi sono in grado di biotrasformazione selettiva regionale e stero selettiva e consentono la risoluzione di miscele racemiche., Le lipasi con le proprietà migliorate sono prodotte dalla selezione naturale e dall’ingegneria delle proteine per lo studio 16S rRNA e per ulteriori studi per migliorare l’utilità di questi enzimi. Contemporaneamente, vengono fatti progressi nelle tecnologie di bioreattore e reazione per utilizzare efficacemente le lipasi. Tuttavia, il tasso di progresso è lento l’elaborazione basata sulla lipasi ha un futuro promettente; I fattori che presentano limitazioni includono il costo lativamente elevato delle lipasi e la mancanza di enzimi con la gamma ottimale di specificità catalitiche e proprietà richieste nelle varie applicazioni.,
RICONOSCIMENTO: Siamo sinceramente grati al Cancelliere e Vice Cancelliere, Kalasalingam University, Krishnankoil, Distretto di Viruthunagar, Srivilliputhur – 626 126 Tamil Nadu.
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Come citare questo articolo:
Muthumari GM, Thilagavathi S e Hariram N: Enzimi industriali: microbi che producono lipasi da sostanze volatili di scarto. Int J Pharm Sci Res 2016; 7 (5): 2201-08.doi: 10.13040 / IJPSR.0975-8232.7(5).2201-08.
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