Laboratorio di microbiologia

La macchia di Gram, originariamente sviluppata nel 1884 da Christian Gram, è probabilmente la procedura più importante in tutta la microbiologia. Deve essere una delle procedure più ripetute eseguite in qualsiasi laboratorio. Gram stava effettivamente usando coloranti sulle cellule umane, e ha scoperto che i batteri legano preferenzialmente alcuni coloranti. La macchia di gram è una macchia differenziale, al contrario della macchia semplice che utilizza 1 colorante. Come risultato dell’uso di 2 coloranti, rendendo questa procedura una macchia differenziale, i batteri diventeranno viola/blu o rosa durante la procedura.,

Prima della colorazione, il campione deve essere montato e fissato sui vetrini, come precedentemente fatto nella tecnica di colorazione semplice. A causa dei 2 coloranti utilizzati nella procedura-crystal violet e safrinin-così come il decolorante acetone-alcol, i batteri cadranno in 2 gruppi in base alla loro reattività gram. I batteri gram positivi mantengono il cristallo viola anche attraverso il decolorizor step: i batteri gram negativi non mantengono il cristallo viola, vengono decolorati e quindi raccolgono il colorante safrinin., Sia gram + che-si legano al cristallo viola: il passo chiave per la loro differenziazione è la decolorazione.

Dai un’occhiata allo schema che accompagna la procedura di colorazione e i suoi effetti sul colore batterico. Durante la fase di cristallo viola-iodio, le molecole legate all’interno del peptidoglicano della parete cellulare gram + e all’interno della membrana sono tenute saldamente. L’acetone-alcol fa sì che le molecole di peptidoglicano (disposte in un reticolo) si restringano, mantenendo così la violetiodina cristallina ancora più stretta., Nella gram-cellula, lo strato esterno del lipopolisaccaride della parete è dissolto dagli agenti del decolorizer e poiché lo strato del peptidoglicano è così sottile in quel gruppo di batteri, il viola di cristallo è lisciviato dalla parete.

Anche se c’è una routine standard e set reagenti utilizzati in questa macchia, ogni persona deve trovare un particolare metodo che funziona meglio per loro., Le molte variabili che possono influenzare questa macchia sono l’età della coltura, la quantità di decolorante utilizzata, il tempo di decolorazione, il tipo di organismo (batteri e spore acido-veloci non si macchiano bene), lo spessore dello striscio e la cura generale del colorante.

I motivi più comuni per le reazioni di falsi grammi?

• Alcune specie batteriche tendono verso gram variabile, e mostrerà entrambi i colori anche se più spesso gram +.
• Sopra decolorizing lo striscio, troppo lungo un tempo.
• Utilizzando vecchie culture (preferibilmente, le culture dovrebbero avere 18-48 ore).,

LA PROCEDURA: fatto individualmente

1. Abbiamo colture di E. coli e Bacillus per colorazione di gram. Questo vi darà gram + e gram-controlli per controllare la procedura contro., Puoi usare 2 diapositive, 1 per ogni batterio, oppure puoi dividere una diapositiva a metà e spalmare ogni batterio sulla diapositiva divisa. Ci sono anche preparati, vetrini gram macchiati di batteri di diverse forme e dimensioni di batteri da guardare.
2. Fai lo striscio batterico da brodo, inclinazione o piastra.
   • Se preso da un brodo, utilizzare 1-2 loop della soluzione di brodo.
   • Se preso da un mezzo di agar solido (piastra o inclinazione), sospendere l’inoculo in una goccia d’acqua sul vetrino e mescolare bene.,
   • Stendere la sospensione sul vetrino in modo che copra un’area almeno delle dimensioni di un nichel, preferibilmente un quarto.
   • Si potrebbe pensare di marcatura la zona striscio con un circostante matita di cera mark in modo che si può trovare la striscio sotto il microscopio facilmente.
   • Posiziona un pezzo di nastro sul lato dello striscio in modo da sapere da che parte è in alto.
3. Lasciare asciugare completamente il vetrino prima di procedere con la procedura.
4. Calore-fissare la diapositiva tenendo la diapositiva ad una estremità con le dita e rapidamente spostandolo avanti e indietro un paio di volte sopra la fiamma.,
5. Eseguire la procedura di colorazione come indicato di seguito.

La procedura di colorazione

• Posizionare il vetrino sulla sovrapposizione della rete metallica sulla vasca di tintura.
• Inondare lo striscio con gocce di cristallo viola, lasciando in per 1 minuto. Lavare BENE con acqua.
• Inondare lo striscio con gocce di iodio di grammo, lasciando in per 1 minuto. Lavare BENE con acqua.
• Flood acetone-alcol rapidamente sul vetrino, e lavare entro 5-10 secondi (dall’inizio del decolorizer aggiunto). Lavare BENE con acqua.
• Inondare lo striscio con gocce di safrinin, lasciando in per 1 minuto., Lavare BENE con acqua.
• Asciugare con carta bibulo prima di posizionarlo sul palco del microscopio per visualizzare.

1. Messa a fuoco su striscio utilizzando lente a bassa potenza, finendo su 100X immersione in olio. Assicurarsi di avere una goccia di olio sulla diapositiva prima di ruotare la lente obiettivo 100X in posizione.
2. Interpretare i risultati utilizzando il protocollo di seguito.

Interpretazione

• I batteri gram positivi saranno blu / viola / viola
• I batteri gram negativi saranno rosa chiaro

1. Identificare le varie forme e disposizioni dei batteri.,
2. PULIRE LE DIAPOSITIVE utilizzando lo slide cleanser ai lavelli.
3. Guarda i vetrini preparati di vari batteri. Vedrete diverse forme e disposizioni. Restituire i vetrini preparati ai vassoi sul banco.

Varie diapositive di batteri