Uno studio comparativo sui diversi metodi di colorazione e sul numero di campioni per la rilevazione di bacilli acidi veloci

Vol. 95 (6): 855-858, novembre./Dec., 2000

Mustafa Ulukanligil+, Gonul Aslan, Sami Tasçi

Dipartimento di Microbiologia, dell’Università di Harran Medical School, Sanliurfa, Turchia

La presenza di bacilli acido-resistenti, in più esemplari è stato studiato comparativamente con Ziehl-Neelsen (ZN) e microscopia di fluorescenza (FM) colorazione per determinare la sensibilità nel rilevare la tubercolosi (TB). Un totale di 465 campioni ottenuti da 295 pazienti sono stati analizzati presso l’Harran University Medical School Hospital tra marzo 1998 e marzo 2000. La cultura è stata impiegata come metodo di riferimento. Sessantotto pazienti (23.,1%) sono stati diagnosticati come affetti da TBC per coltura. Le sensibilità alla colorazione ZN e FM erano rispettivamente del 67,6% (46/68) e dell ‘ 85,2% (58/68). Duecentoun paziente (68,1%) ha presentato un campione al laboratorio. La positività alla TB è stata rilevata in 42 (20,9%) di questi pazienti per coltura. Le sensibilità delle macchie ZN e FM sono risultate del 61% e dell ‘ 83% in questi pazienti. Tuttavia, in 18 pazienti (6,1%) che hanno presentato due campioni al laboratorio, la TUBERCOLOSI è risultata positiva in sei di essi (33,3%) e le sensibilità ZN e FM erano rispettivamente del 66% e dell ‘ 83%., Quando tre campioni o più sono stati raccolti dai pazienti (76 pazienti, 25,8%), la positività alla TB è stata determinata in 20 di essi (26,3%) e la sensibilità è stata dell ‘ 80% e del 92% negli strisci colorati con ZN e FM, rispettivamente.

I nostri dati indicano che nella diagnosi di TB, FM ha una maggiore sensibilità rispetto a ZN. In particolare, nel caso di un singolo campione, il valore diagnostico di FM è piuttosto significativo. È quindi possibile concludere che sia la colorazione ZN che FM possono essere utilizzate per la diagnosi di TB quando ci sono più di due campioni., Tuttavia, se sono disponibili solo uno o due campioni, è preferibile la colorazione FM.

parole Chiave: Mycobacterium tuberculosis – sensibilità – di Ziehl Neelsen – microscopia di fluorescenza

la Tubercolosi (TB) rimane un problema di salute importante, con una stima di 8 milioni di nuovi casi e 3 milioni di decessi a causa di questa malattia ogni anno in tutto il mondo (Dixie et al.1993). Trecento a quattrocento nuovi casi sono segnalati ogni anno a Sanliurfa, Turchia su una popolazione 400.000 (S. urfa tuberculosis dispensary statistics report, 1998)., Diversi fattori sono responsabili dello scoppio della TUBERCOLOSI nella regione: il deterioramento delle condizioni socio-economiche, con basso reddito e istruzione inadeguata, e grande ignoranza della malattia, come dimostrato dal fatto che i pazienti spesso smettono di prendere medicine quando i loro sintomi sono scomparsi. Sebbene il virus dell’immunodeficienza umana sia il fattore principale nei focolai di TUBERCOLOSI in luoghi come gli Stati Uniti e l’Africa, è piuttosto raro nel sud della Turchia.

La maggior parte dei libri di testo di laboratorio standard (Janda 1997, Sommers et al., 1988) e le linee guida per i laboratori di micobatteriologia (Kent & Kubica 1985) suggeriscono che almeno tre campioni, preferibilmente raccolti in tre giorni consecutivi, devono essere presentati al laboratorio per striscio e coltura di bacilli acido-veloci (AFB) da parte di pazienti sospettati di avere la tubercolosi. La rilevazione di AFB in strisci diretti preparati con sputa concentrata, urina e campioni di altri fluidi corporei ha un notevole valore clinico ed epidemiologico e rimane il test diagnostico rapido più utilizzato per la TUBERCOLOSI nella maggior parte dei paesi in via di sviluppo (Nelson et al. 1998)., Mentre nuove tecniche diagnostiche radiometriche e molecolari sono state sviluppate e sono ampiamente utilizzate nel mondo sviluppato (Heifets 1997), si stima che tra il 60% e il 70% di tutti i casi di TUBERCOLOSI siano diagnosticati mediante esame a striscio dell’espettorato (Guthie et al. 1993). Due metodi tradizionali di colorazione, vale a dire microscopia a fluorescenza (FM) e il metodo Ziehl-Neelsen (ZN) sono facilmente disponibili (Nagpaul 1967). Il metodo ZN è stato comunemente utilizzato in tutto il mondo, in particolare nei paesi in via di sviluppo, a causa della sua semplicità e basso costo (Guthie et al. 1993)., Diversi rapporti (Lempert 1944, Boyd & Marr 1975, Janda 1997) hanno indicato che FM ha una maggiore sensibilità e consente di risparmiare tempo rispetto al metodo ZN. Uno svantaggio della tecnica FM è che a volte può produrre risultati falsi positivi. Tuttavia, la maggior parte di questi può essere prevenuta ripristinando lo striscio secondo il metodo ZN per microscopia a luce brillante (Holst et al. 1959, Heifets 1997).,

Nel presente studio, queste due tecniche sono state confrontate in termini di sensibilità nella diagnosi di TB ed è stata esaminata la correlazione tra sensibilità e numero di campioni raccolti. Inoltre, alla luce dei nostri risultati e della letteratura disponibile, abbiamo cercato di identificare quelle tecniche adatte alle nostre circostanze.,

MATERIALI E METODI

RISULTATI

DISCUSSIONE

MATERIALI E METODI

duecento e novanta-cinque paziente con sospetta TB sono stati di cui il nostro clinic (Clinica Laboratorio di Microbiologia, dell’Università di Harran Scuola Medica Ospedaliera) e un totale di 460 campioni sono stati raccolti da loro tra Marzo 1998-Marzo 2000., Questi campioni consistevano in 430 espettorato, 17 urina, 4 lavanda gastrica e 3 campioni di ascesso cervicale, 3 fluidi pleurici, 1 liquido peritoneale, 1 campione bioptico linfonodale cervicale e 1 campione di sperma.

Tutti i campioni di espettorato sono stati decontaminati e concentrati utilizzando la procedura di N Acetil-L-Cisteina-Idrossido di sodio raccomandata dal Center of Disease Control and Prevention (Kent& Kubica 1985)., L’espettorato, l’urina e altri campioni sono stati preparati utilizzando il metodo di centrifugazione convenzionale e gli strisci sono stati colorati con macchie di carbolfuchsina (ZN) e Auramin-O (fluorocromo) (Ebersole 1995). L’espettorato, l’urina e altri sedimenti del campione sono stati inoculati su terreni di Lowenstein-Jensen e incubati a 37oC in 5% di CO2 per un massimo di sei settimane (Lambi 1995). La cultura è stata utilizzata come metodo di riferimento e confrontata con le tecniche ZN e FM., Nella registrazione dei numeri AFB determinati negli strisci colorati in microscopia ad immersione (ingrandimento x1000), è stata utilizzata la seguente scala di segnalazione: più di 9 AFB per campo (4+), 1-9 AFB per campo (3+), 1-9 AFB per 10 campi (2+), 1-9 AFB per 100 campi (1+). Quando solo pochi AFB sono stati rilevati in 300 campi, i risultati sono stati considerati discutibili. Per equiparare il numero di bacilli osservati con FM (ingrandimento 400x) al numero di bacilli osservati con microscopia ad immersione (ingrandimento 1000x), i valori sono stati divisi per 4 (American Thoracic Society 1981).,

RISULTATI

Duecentoun pazienti (68,1%) hanno presentato un campione per l’esame AFB e in 42 (20,9%), l’organismo è stato isolato da espettorato (40 casi), materiale ascesso (1 caso) e materiale biopsia linfonodale (1 caso). In questi 42 pazienti, 28 campioni di espettorato hanno dato risultati positivi con colorazione ZN e 38 (37 espettorato, 1 ascesso cervicale) hanno dato risultati positivi con colorazione FM. Le sensibilità della colorazione ZN e FM erano rispettivamente del 61% e dell ‘ 83% (p<0,05) (Tabella II).,

Abbiamo osservato che gli strisci che erano positivi sia con ZN che con FM contenevano da 1 a 9 AFB per campi. I 14 strisci positivi, che non sono stati rilevati con strisci macchiati con ZN, sono stati rilevati bacilli a bassa densità (1-2 bacilli per 100 campi) su strisci macchiati con FM. Solo un risultato falso positivo è stato visto con il metodo FM, quindi, le specificità della colorazione ZN e FM sono state trovate rispettivamente come 100% e 99%.

Diciotto (6,1%) pazienti hanno presentato due campioni al laboratorio e nel 33,3% (6 su 18) di questi pazienti, l’organismo è stato recuperato in 1 o 2 dei campioni di espettorato., Quattro di questi hanno prodotto risultati positivi con colorazione ZN (sensibilità, 66%) e 5 hanno prodotto risultati positivi con colorazione FM (sensibilità, 83%). Due pazienti positivi non sono stati rilevati sulla base di strisci macchiati di ZN. Gli strisci di un paziente, che erano macchiati con MF, contenevano 3-5 bacilli in ogni 30-40 campi mentre gli strisci dell’altro paziente erano negativi sia con FM che con ZN. Nessun risultato falso positivo è stato rilevato in questi pazienti.

Tre o più campioni sono stati presentati dal 25,8% dei pazienti (76 su 153) e da 20 di questi pazienti (26.,3%) sono stati diagnosticati come TB isolando l’organismo in uno o più campioni di espettorato. Sedici di loro hanno prodotto risultati positivi con colorazione ZN (sensibilità, 80%) e 18 hanno prodotto risultati positivi con colorazione FM (sensibilità, 92%). Nessun risultato falso positivo è stato rilevato in questi pazienti (Tabella II).

Diciassette campioni di urina sono stati raccolti per AFB, ma nessuno di questi è risultato positivo in strisci o colture macchiate., Allo stesso modo, altri campioni (3 liquido pleurico, 4 lavanda gastrica, 1 liquido peritoneale, 2 campioni di ascesso cervicale e 1 campione di sperma) sono risultati negativi con colorazione e coltura ZN e FM, ad eccezione di un campione di ascesso cervicale che ha dato un risultato positivo con colorazione e coltura FM. Un campione linfonodale cervicale ha prodotto M. tuberculosis solo in coltura.

DISCUSSIONE

La Turchia è un paese in via di sviluppo e la TUBERCOLOSI è ancora una malattia comune, in particolare nel sud-est della contea., A Sanliurfa, una città nel sud-est, le condizioni economiche sono ancora molto povere e ogni anno vengono registrati 300-400 nuovi pazienti affetti da TUBERCOLOSI.

Negli ultimi anni sono state sviluppate diverse tecniche radiometriche e molecolari per la diagnosi di TB. Le tecniche radiometriche riducono il tempo di turnover per AFB. Tuttavia, non sono adatti per questa regione della Turchia a causa del loro costo elevato (Heifets 1997). C’è poco spazio anche per l’utilizzo di tecniche molecolari a causa delle nostre limitate risorse finanziarie. I metodi convenzionali come ZN e FM sono tecniche rapide e semplici con costi piuttosto bassi., Solo ZN è stato finora utilizzato per la diagnosi di TUBERCOLOSI in questa regione. Tuttavia, ha un basso livello di sensibilità rispetto al metodo FM. Il presente studio è stato il nostro primo tentativo di utilizzare FM e confrontarlo con ZN.

Abbiamo effettuato in uno studio comparativo l’affidabilità dei metodi FM e ZN nell’esame degli strisci per AFB. Abbiamo scoperto che le specificità di FM e ZN erano 99% e 100%, e le sensibilità con un campione erano 83% e 61%, rispettivamente. Quando il numero di campioni è stato aumentato, la sensibilità di entrambi i tipi di colorazione è aumentata., Quando abbiamo utilizzato più di due esemplari, le sensibilità sono risultate simili. Pertanto, è possibile dire che se abbiamo meno di tre campioni, l’affidabilità di FM è molto maggiore di quella di ZN. A meno che non è stato presentato più di un campione, che non era facile condizioni socio-economiche e culturali esistenti, FM dimostrato di essere più affidabile del metodo ZN. Inoltre, un altro vantaggio di FM era che ha permesso il rilevamento di strisci positivi, che sono stati trascurati con strisci ZN macchiati contenenti bacilli a bassa densità., L’uso di FM aumenta significativamente il valore diagnostico dello striscio, in particolare dove ci sono bacilli a bassa densità che possono sfuggire al rilevamento su strisci macchiati di ZN. I nostri risultati erano in accordo con quelli di Guthie et al. (1993), Ba e Rieder (1999), e Pollack e Wieman (1977), che hanno riferito che FM sembra essere più probabile rilevare TB in strisci che contengono bacilli a bassa densità.

Molti rapporti (Sommers et al. 1988, Nelson et al., 1998) hanno dimostrato che i micobatteri possono essere rilasciati irregolarmente dai polmoni e che è persino possibile trovare risultati positivi e negativi nello stesso paziente durante lo stesso periodo. Pertanto, si consiglia di raccogliere più di un campione da pazienti sospettati di avere la TUBERCOLOSI. Alcuni altri rapporti (Ozturkeri et al. 1997, Durupinar et al. 1997, Pollock& Wieman 1997) hanno affermato che potrebbero verificarsi reazioni false positive con FM. Abbiamo osservato solo un risultato falso positivo nel presente studio., Inoltre, non si sono verificate reazioni false positive nella nostra indagine con il metodo ZN.

La nostra priorità in questo studio era trovare un metodo rapido ed economico per la diagnosi di TUBERCOLOSI in Sanliurfa. Concludiamo che il metodo FM è abbastanza economico in termini di tempo e costi ed è raccomandato per i laboratori che gestiscono un gran numero di campioni di espettorato. Abbiamo scoperto che FM è più affidabile di ZN. Tuttavia, tutto il personale che deve esaminare i campioni di espettorato dovrebbe acquisire familiarità con FM al fine di prevenire risultati falsi positivi e/o negativi., Pertanto, si suggerisce che fino a quando non ci sia personale qualificato per l’indagine di AFB, gli strisci dovrebbero essere macchiati con entrambe queste macchie e quindi esaminati in modo comparativo. Dopo che il personale di laboratorio ha familiarizzato con il metodo FM, questo metodo può essere utilizzato di routine da solo.

  • American Thoracic Society 1981. Standard diagnostici e classificazione della tubercolosi e di altre malattie my-cobacterial. Am Rev Respir Dis 123: 343-358.
  • Ba F, Rieder HL 1999., Un confronto della microscopia a fluorescenza con la tecnica Ziehl-Neelsen nell’esame dell’espettorato per bacilli acidi veloci. Int J Tuberc Lung Dis 3: 1101-1105.
  • Boyd JR, Marr JJ 1975. Diminuzione dell’affidabilità delle tecniche di striscio acido veloce di rilevamento della tubercolosi. Ann Stagista Med 82: 487.
  • Dixie E, Snider JR, Dooley WS 1993. Tubercolosi nozocomiale nell’era dell’AIDS con enfasi sulla malattia multi resistente ai farmaci. Cuore e polmone 22: 365-369.
  • Durupýnar B, Birinci A, Gunaydýn M, Sanic A 1997., L’affidabilità della tecnica di colorazione auramina-rodamina nella diagnosi della tubercolosi. Bull Microbiol 31: 369-374.
  • Ebersole LL 1995. Procedure di colorazione acido-veloce in micobatteriologia. Nella MH Isenberg, Clinical Microbiology Procedures Handbook, Amer Soc Mi-crobiol, Washington DC, Sezione 3.5.
  • Guthie W, Kitui F, Juma ES, Obvana DO, Mwai J, Kwamanga D 1993. Uno studio comparativo sull’affidabilità della microscopia a fluorescenza e del metodo Ziehl-Neelsen nella diagnosi della tubercolosi polmonare. Est Afri Med J 70: 263-266.
  • Heifets L 1997. Laboratorio di micobatteriologia., Med petto Clin 18: 35-41 .
  • Holst E, Mitchson DA, Radhakrishna S 1959. Esame di strisci per bacilli tubercolari mediante microscopia a fluorescenza. Ind J Med Res 47: 495.
  • Janda WM 1997. Micobatteri. In EW Koneman, SD Allen( eds), Atlante di colore e libro di testo di microbiologia diagnostica, 5 ed., JB Lippincott Co., Philadelphia, p. 893-949.
  • Kent PT, Kubica GP 1985. Salute pubblica Mycobacte-riology: A Guide for Level III Laboratory, US Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta, p. 3-10.
  • Lambi EA 1995., Media selezione e incubazione per l’isolamento dei micobatteri in micobatteriologia. Nella MH Isenberg, Clinical Microbiology Procedures Handbook, Amer Soc Microbiol, Washington DC, Sezione 3.6.
  • Lempert H 1944. Microscopia a fluorescenza nel rilevamento bacilli tubercolari. Lancetta 2: 818.
  • Nagpaul DR 1967. Programma di controllo della tubercolosi distrettuale in concetto e schema. Ind J Tubercolo 14: 186.
  • Nelson SM, Deike MA, Cartwright CP 1998. Valore dell’esame di più campioni di espettorato nella diagnosi di tubercolosi polmonare. J Clin Microbiol 36: 467-469.,
  • Ozturkeri H, Demir MA, Balli S, Aydilek R 1997. Valutazione comparativa di diversi metodi di colorazione nella diagnosi della tubercolosi. Bull Microbiol 31: 231-236.
  • Pollock HM, Wieman EJ 1977. Risultati di striscio nella diagnosi di micobatteriosi usando la microscopia a fluorescenza a luce blu. Microbiolo Clin 5: 329-331.
  • Sommers HM, McClatchy JK, Morello JA 1988. Diagnosi di laboratorio della micobatteriosi, CUMITECH 16, Amer Soc Microbiol Washington DC, p. 3-8.,

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