aprobación ética, consentimiento informado y ubicación del estudio
todos los procedimientos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de Boulder de la Universidad de Colorado. Se explicó a todos los sujetos la naturaleza, los beneficios y los riesgos del estudio, y se obtuvo su consentimiento informado por escrito antes de la participación., Todas las mediciones se realizaron en el Centro de Investigación Traslacional (CTRC) de la Universidad de Colorado Boulder Clinical & y en el laboratorio de Fisiología integrativa del envejecimiento. El estudio fue registrado en ClinicalTrials.gov bajo el identificador NCT02921659.
los participantes del estudio
hombres de mediana edad y mayores y mujeres posmenopáusicas de 55 a 79 años fueron reclutados de Boulder Colorado y comunidades circundantes. Todos los sujetos estaban libres de enfermedades clínicas, incluyendo enfermedad arterial periférica (índice tobillo-brazo >0.,90) y ECV manifiesta evaluada por una prueba de ejercicio graduada, análisis de sangre basal, historia clínica y examen físico por un médico., Todos los sujetos demostraron Alteraciones Relacionadas con la edad en la función endotelial vascular (definida como un valor de dilatación mediada por flujo <6%) y se excluyeron si presentaban bioquímica sanguínea anormal para la función renal o hepática (definida como 1 desviación estándar fuera del rango normal), tenían dependencia del alcohol, enfermedad tiroidea no controlada, obesidad grave (índice de masa corporal >40 kg m-2), o peso estable durante al menos 3 meses antes de inscribirse en el estudio (definido como >2 kg de cambio en la masa corporal)., La masa corporal, el IMC y las circunferencias de cintura y cadera se midieron por antropometría, y el porcentaje total de grasa corporal se midió mediante absorciometría de rayos X de doble energía (lunar / Prodigy, GE). La glucosa en ayunas y los niveles de colesterol total, LDL y HDL se midieron mediante ensayos estandarizados en el Laboratorio Central CTRC de la Universidad de Colorado en Boulder al inicio y después de cada fase de intervención del estudio.
diseño del estudio, aleatorización e intervención
el diseño del estudio consistió en un ensayo clínico cruzado aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo de 2 × 6 semanas., Sujetos ingeridos cloruro de ribósido de nicotinamida (NIAGEN®; 500 mg, dos veces al día; ChromaDex, Inc.) y cápsulas de placebo durante 6 semanas cada una en un orden determinado aleatoriamente. Los sujetos fueron aleatorizados después de dar su consentimiento informado y cumplir con todos los criterios de inclusión. La aleatorización fue realizada por un miembro del equipo del estudio que no participó en la evaluación de los resultados. Los participantes del estudio y los miembros del equipo del estudio que participaron en la recopilación y el análisis de los resultados no conocían la condición del tratamiento. Las cápsulas se consumían con las comidas por la mañana y por la noche., Los sujetos se abstuvieron de tomar cualquier medicamento de venta libre durante 48 h y medicamentos recetados durante 24 h antes de todas las pruebas experimentales. Todas las evaluaciones se realizaron después de un ayuno nocturno de 12 h con la excepción de las pruebas de función motora, que se realizaron 2 h después de una comida ligera o merienda con el fin de asegurar que los sujetos tenían suficiente energía para completar la batería de prueba. Los sujetos se abstuvieron de consumir alcohol o hacer ejercicio vigoroso durante 24 h y se abstuvieron de tomar píldoras del estudio durante al menos 12 h antes de todas las sesiones de prueba.,
evaluación de la seguridad y tolerabilidad
la adhesión a la intervención fue evaluada por el recuento de pastillas. Los sujetos informaron al laboratorio cada 2 semanas para recibir una nueva botella de cápsulas y discutir cualquier problema con la tolerabilidad o los ea surgidos del tratamiento con un miembro del equipo de investigación que no participó en la recopilación o el análisis de datos para garantizar el cegamiento de los investigadores., Los marcadores clínicos estándar de Hematología, función hepática y renal y lípidos sanguíneos se analizaron mediante ensayos clínicos estandarizados en Boulder Community Hospital y cualquier resultado anormal en sangre fue revisado por el médico del estudio.
aislamiento de células mononucleares de sangre periférica
se aislaron PBMCs de 35 ml de sangre total recolectada en tubos Vacutainer™ recubiertos con EDTA. La sangre se centrifugó a 400 × g durante 20 min y la mayor parte de la capa de plasma (~60%) se eliminó para aumentar la eficiencia del aislamiento de PBMC aguas abajo., La muestra restante se añadió lentamente a un nuevo tubo cónico de 50 ml que contenía 10 ml de Histopaco 1.077 (Greiner Bio-One) y la capa de células mononucleares se aisló mediante centrifugación dependiente de la densidad a 400 × g durante 20 min, se lavó y luego se congeló en 2 ml de PBS a -80°C.
materiales
preparación de estándares de calibración
los estándares individuales se prepararon disolviendo 10 mg ml-1 en 1:1 metanol:agua y luego combinar para obtener una mezcla de caldo., La reserva combinada de metabolito NAD+ se preparó a 100 µg ml−1 de cada compuesto y la reserva combinada de nucleósido/nucleótido se preparó a 400 µg ml−1 de cada compuesto; ambos se congelaron a -20 °C hasta su uso. La solución patrón interna se preparó a 250 µg / ml de adenosina-13c5, trifosfato de adenosina-d4, ribósido de nicotinamida doblemente marcado y 2,5 µg ml−1 de NaM-13c6 en metanol 1:1:Agua., Inmediatamente antes del análisis de cada lote de muestras, se prepararon los estándares individuales de la curva de calibración combinando las existencias de nad+ y nucleósido/nucleótido en una proporción de 1:1 y luego diluyéndolas en metanol:agua 1:1 a las concentraciones requeridas. Las concentraciones oscilaron entre 0,025 y 25 µg ml-1 para los metabolitos NAD+ y entre 0,1 y 100 µg ml−1 para los nucleósidos/nucleótidos. Las concentraciones estándar internas en todos los niveles de calibración y muestras fueron de 50 µg ml-1 para adenosina-13c5, trifosfato de adenosina−d4 y ribósido de nicotinamida doblemente marcado, y 0,5 µg ml-1 para NaM-13c6.,
extracción de metabolitos NAD+ y nucleósidos/nucleótidos
PBMCs congelados (5×10e6 células en total) se descongelaron en hielo. 500 µl de metanol frío 70:30:se añadió agua junto con 20 µl de patrón interno y las muestras se vorticearon durante 10 s. El extracto resultante se centrifugó a 8000 × g durante 5 min a 4 °C. el sobrenadante resultante se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga y se almacenó en hielo. Al pellet restante, se añadieron 500 µl de metanol frío y la muestra se agitó durante 10 s para resuspender el pellet. La muestra se centrifugó a 8000 × g durante 5 minutos a 4 °C., Se eliminó todo el sobrenadante y se combinó con el sobrenadante de metanol al 70%. El pellet resultante se reservó y congeló a -70 ° C para el análisis de la concentración de proteínas utilizando el ensayo de Bradford. Los sobrenadantes combinados se centrifugaron a 18.000 × g durante 15 minutos y el sobrenadante resultante se transfirió a un nuevo tubo y se secó en una centrífuga de vacío a 55 °C. Las muestras secas se reconstituyeron en 100 µl de metanol:agua 1:1 y se centrifugaron a 18.000 × g durante 10 minutos a 4 °C. el sobrenadante se transfirió luego a un vial de autosampler de actividad superficial reducida para su análisis.,
LC-MS
la separación por HPLC de metabolitos NAD+ y nucleósidos / nucleótidos se realizó utilizando un método descrito por Evans et al.59 con modificaciones menores. La separación de metabolitos NAD+ y nucleósidos / nucleótidos se realizó en una HPLC de la serie 1200 de Agilent (Santa Clara, CA) utilizando una columna Luna NH2 de 100 × 2 mm y 5 µm de Phenomenex (Torrance, CA) operada en modo HILIC. El tampón a consistió en acetonitrilo al 100% y el tampón B consistió en agua 95:5 con acetato de amonio de 20 mm ajustado a pH 9,6 con hidróxido de amonio de 20 mm., Se analizaron diez microlitros de la muestra extraída utilizando el siguiente gradiente a un caudal de 0,6 ml por min: gradiente lineal de 5 a 100% B durante 6 min, retención a 100% B de 6 a 9,5 min, luego 100-5% B de 9,5 a 10,5 min, seguido de reequilibrio a 5% B de 10,5 a 14 min. La temperatura de la columna se mantuvo en 15 °C para todo el gradiente. El análisis espectrométrico de masas se realizó en un espectrómetro de masas de Triple cuadrupolo Agilent 6410 en modo de ionización positiva. El gas de secado fue de 300 ° C a un caudal de 12 ml por minuto. La presión del nebulizador fue de 30 psi., La tensión capilar fue de 4000 V. Los datos de metabolitos NAD+ y nucleósidos / nucleótidos se adquirieron en modo MRM utilizando Condiciones optimizadas experimentalmente obtenidas mediante análisis de inyección de flujo de estándares auténticos (tabla suplementaria 5). Los estándares de calibración se analizaron en un rango de concentraciones de 0,25 a 250 ng en la columna para los metabolitos NAD+ y de 1 a 1.000 ng en la columna para los nucleósidos/nucleótidos. Se construyeron curvas de calibración para cada metabolito NAD+ y nucleósido/nucleótido utilizando el software de análisis cuantitativo Agilent Masshunter., Los resultados para PBMCs fueron cuantificados utilizando las curvas de calibración para obtener la concentración en columna, seguido de la normalización de los resultados utilizando la concentración de proteína del pellet reservado de la extracción de PBMC.
las evaluaciones de la función cardiovascular
la presión arterial en reposo se midió en posición sentada después de al menos 10 min de descanso tranquilo utilizando un dispositivo de presión arterial semiautomatizado (Dynamap™ XL, Johnson & Johnson, Arlington, TX, EE., Las mediciones se realizaron múltiples veces desde el brazo no dominante, con 2 min de reposo tranquilo entre grabaciones. Se realizaron mediciones repetidas hasta que se obtuvieron tres valores de presión arterial que estaban dentro de 5 mmHg uno del otro. Estos valores se promediaron para determinar la presión arterial sistólica y diastólica en reposo y la presión del pulso. Los valores basales de la presión arterial se obtuvieron utilizando el protocolo descrito anteriormente en dos días de prueba separados antes del inicio del primer grupo de intervención y se promediaron para determinar el estado basal de la presión arterial (es decir, normal vs., por encima de lo normal) para análisis posteriores.
la rigidez aórtica se midió utilizando el VOP carótida-femoral, la evaluación estándar de oro de la rigidez de la arteria elástica en humanos38. Las formas de onda de presión se registraron simultáneamente de las arterias carótida y femoral utilizando tonometría de aplanación (Millar Inc., Houston,Texas) como se describió anteriormente en nuestro laboratorio60,61, 62. El tiempo de tránsito de la onda de pulso aórtico se determinó midiendo el tiempo de retardo entre el pie de las ondas de presión carotídea y femoral utilizando el software de análisis LabChart., La VOP se calculó dividiendo la distancia entre los dos sitios de medición por el tiempo de tránsito aórtico.
el cumplimiento de la arteria carótida se determinó por el cambio en el diámetro de la arteria carótida común derecha (evaluado mediante ultrasonografía de alta resolución, PowerVision 6000, Toshiba) en relación con el cambio en la presión arterial carótida (evaluado mediante tonometría de aplanación, Millar Inc. Houston, TX) a través del ciclo cardíaco., La presión carotídea se normalizó a presión arterial braquial obtenida mediante un manguito automático de presión arterial (Dynamap ™ XL, Johnson & Johnson, Arlington, TX, EE. El cumplimiento se calculó como CC = π × DD2 × (ΔD DD−1)/(2 × PP), donde DD es diámetro diastólico, ΔD es el cambio de diámetro y PP es la presión del pulso arterial, Como se ha descrito previamente62,63,64,65.,
la dilatación dependiente del endotelio se midió como dilatación mediada por el flujo de la arteria braquial (DMF) a hiperemia reactiva, utilizando ultrasonografía de alta resolución (PowerVision 6000, Toshiba) como se describió previamente66,67,68. La DMF se expresó como el cambio porcentual (%Δ) con respecto al diámetro basal.
las evaluaciones de la función metabólica
se recolectaron registros dietéticos de tres días al inicio y durante la última semana de cada fase de intervención para garantizar la estabilidad de la ingesta calórica., Los resultados fueron analizados por un dietista registrado utilizando el Nutrition Data System for Research (Universidad de Minnesota), tal como fue descrito previamente por nuestro laboratorio67, 69.
La tasa metabólica en reposo se midió mediante calorimetría indirecta (ParvoMedics TrueOne 2400), tal y como se ha descrito anteriormente en nuestro laboratorio70, 71. Los sujetos descansaron en posición supina durante 45-60 min con una capucha ventilada colocada sobre su cabeza para recoger las concentraciones de oxígeno expirado (O2) y dióxido de Carbono (CO2)., La tasa metabólica y la razón de intercambio respiratorio (RER) se calcularon en segmentos de 1 min y se promediaron a partir de al menos 30 min de datos estables.
la sensibilidad a la insulina se evaluó midiendo la captación de glucosa en todo el cuerpo estimulada por insulina utilizando una prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa modificada con muestras frecuentes y el método de análisis Modelo Mínimo descrito en detalle en otro lugar72. La resistencia a la insulina y la sensibilidad de las células beta se evaluaron utilizando el método homeostasis model assessment (HOMA) como se describió previamente73.,
las evaluaciones de la capacidad de ejercicio y la función física
la aptitud cardiorrespiratoria se determinó a partir de una prueba de ejercicio en cinta de correr graduada hasta el agotamiento volitivo utilizando un protocolo de Balke modificado como se describió previamente74. El consumo de oxígeno (VO2) y la RER se midieron mediante espirometría de circuito abierto con un sistema de análisis online asistido por ordenador. La frecuencia cardíaca y las calificaciones de esfuerzo percibido (RPE) también se midieron a lo largo de la prueba.,
La resistencia al caminar se evaluó midiendo la distancia recorrida durante una tarea de caminata de 6 minutos en un recorrido interior de 50 pies (ida y vuelta) como se describió previamente75.
la fuerza muscular y la tasa de desarrollo del torque se cuantificaron midiendo la fuerza pico producida durante una contracción voluntaria máxima, y la tasa de desarrollo del torque se midió utilizando la tasa máxima de desarrollo del torque durante una contracción rápida y contundente de los músculos flexores y extensores de la rodilla, como se describió anteriormente en nuestro laboratorio76. La fuerza de la empuñadura se midió utilizando un dinamómetro de empuñadura estándar.,
la fatigabilidad de la pierna se evaluó utilizando el rendimiento hasta el fracaso durante una tarea de elevación del talón de una sola pierna. Se pidió a los sujetos que realizaran una contracción de flexión plantar completa cada 2 s hasta el fracaso, y la prueba se terminó cuando el sujeto se detuvo voluntariamente debido a la incomodidad o incapacidad para lograr al menos el 50% de la flexión plantar máxima sin usar las extremidades superiores por más de balance77. El atributo crónico de fatiga también se evaluó mediante un cuestionario de fatiga y una escala de severidad de Fatiga78.
el equilibrio dinámico se evaluó mediante una prueba de paso rápido., La longitud máxima del paso se midió en cada dirección (adelante, atrás, izquierda, derecha), y los objetivos se colocaron en el suelo al 80% del máximo del sujeto con líneas de cinta de color, como se describió previamente79. El rendimiento se cuantificó como el tiempo necesario y el número de errores cometidos en promedio durante tres rondas de la prueba de equilibrio rápido por etapas. Cada ronda consistía en 18 comandos que instruían a los sujetos a caminar con un pie al azar a una dirección aleatoria (es decir, frente izquierdo)., Un error se definió como la falta de paso completamente más allá del objetivo, la pérdida de equilibrio, la falta de retorno a la posición inicial inicial, tomar varios pasos para alcanzar completamente un objetivo, o caminar con la pierna incorrecta o hacia el objetivo equivocado.
la movilidad fue evaluada como el tiempo para completar una tarea de caminata de 4 m (realizada en duplicado a la velocidad de marcha preferida de los sujetos) y la prueba de sentado a pie cinco veces repetida (realizada en triplicado), como se describió previamente75,78,80., La prueba consiste en levantarse de una posición sentada en una silla de altura estándar cinco veces, lo más rápido posible, sin usar sus brazos para el impulso o el apoyo.
la destreza Manual se evaluó como el tiempo para completar una prueba de tablero de 9 hoyos como se describió previamente76. Los sujetos recolectaron clavijas lisas y redondeadas de un plato y las colocaron en un tablero de clavijas, luego las devolvieron al plato lo más rápido posible. Se completaron dos pruebas con cada mano.,
análisis estadísticos
El tamaño de la muestra para este estudio fue suficiente para detectar al menos un aumento del 50% en la concentración de NAD+ después de la suplementación con NR frente a placebo (tamaño del efecto = 0,7; media de diferencia = 7; 1−β = 0,8; α = 0,05), así como una mejoría clínicamente relevante en el parámetro cardiovascular con el menor tamaño del efecto (DMF; diferencia media = >1%; Tamaño del efecto = 0,86). La estimación del tamaño del efecto para NAD+ se determinó a partir de los datos preliminares de las concentraciones de metabolito NAD+ en PBMCs recogidos de sujetos humanos., El tamaño del efecto para la DMF se determinó a partir de las intervenciones cruzadas previas de nuestro laboratorio que demostraron mejoras en la función vascular67. Se determinó que el tamaño de la muestra requerida era de 19 sujetos. Suponiendo un abandono del 20% (4 sujetos) y una exclusión del 40% por fallos en los exámenes de detección (consistente con otros estudios de intervención en nuestro laboratorio con suplementos dietéticos81,82), un total de 60 participantes dieron su consentimiento para este estudio. La significación se fijó en α = 0,006 para todos los resultados secundarios para ajustar las pruebas múltiples de NR vs., placebo (pruebas t pareadas) en cada una de las siguientes nueve hipótesis pre-especificadas: (1) metabolitos NAD+, (2) parámetros cardiovasculares, (3) Hematología, (4) panel metabólico, (5) perfiles lipídicos, (6) balance energético, (7) control glucémico, (8) función motora y (9) rendimiento del ejercicio. Debido a que muchas de las medidas dentro de cada hipótesis están correlacionadas entre sí (por ejemplo, medidas cardiovasculares, tabla complementaria 9), cada grupo de medidas enumeradas anteriormente se trató como un resultado cuando se ajustó para comparaciones múltiples., Con la excepción de nuestras variables de resultado primarias (metabolitos NAD+: NAD+, NAAD, NADP, NaM, NMN), en las que las inferencias se basaron en un nivel alfa no AJUSTADO establecido en 0,05, todas las inferencias de significación se basan en el nivel alfa ajustado por Bonferroni (α = 0,006).
la intención de este estudio fue traducir evidencia preclínica prometedora para la eficacia de la suplementación crónica con compuestos potenciadores de NAD+ a los seres humanos. Por lo tanto, cada resultado fue probado bajo una hipótesis direccional que fue determinada a priori, con base en estudios previos reportados en la literatura., En consecuencia, se utilizaron pruebas de hipótesis de una cola para comparar los efectos Unidireccionales propuestos de la suplementación con NR vs. placebo en estos resultados. Este método se ha recomendado en otros lugares para los ensayos clínicos de fase I y II controlados con placebo en los que el objetivo es obtener una visión temprana de la eficacia potencial de un compound83.
antes del análisis, todas las variables de desenlace continuo fueron evaluadas para la normalidad utilizando la prueba de Shapiro−Wilk y examinando histogramas de frecuencia individuales para cada desenlace., Si una variable no estaba distribuida normalmente, se transformaba logarítmicamente antes del análisis. Si la transformación logarítmica no normalizaba los datos, la condición del tratamiento se analizó mediante la prueba de rango con signo de Wilcoxon no paramétrica. Para cada variable, cualquier sujeto con un valor faltante durante cualquiera de las fases fue excluido de ese análisis. Sobre la base de la interpretación de los datos primarios, se realizaron análisis post-hoc para comparar el cambio en la presión arterial y la rigidez aórtica entre los sujetos que mostraron una presión arterial normal frente a una presión arterial basal superior a la normal utilizando una prueba t de dos colas no emparejada., También exploramos la relación entre las concentraciones basales de NAD+ y el aumento global de NAD+ utilizando una correlación de Pearson. No se incluyó un período de lavado formal en el diseño del estudio; sin embargo, dado el diseño cruzado, se probó la presencia de un efecto de arrastre para cada uno de los resultados en estudio utilizando regresión lineal modelada con un indicador de orden de tratamiento (no se observaron efectos de arrastre entre Condiciones). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la plataforma de computación estadística R (versión 3.2.2) y el software GraphPad Prism 7.
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