Laboratorio de Microbiología

la tinción de gram, desarrollada originalmente en 1884 por Christian Gram, es probablemente el procedimiento más importante en toda la microbiología. Tiene que ser uno de los procedimientos más repetidos realizados en cualquier laboratorio. Gram estaba usando tintes en células humanas, y encontró que las bacterias se unen preferentemente a algunos tintes. La tinción de Gram es una tinción diferencial, a diferencia de la tinción simple que utiliza 1 tinte. Como resultado del uso de 2 tintes, haciendo de este procedimiento una tinción diferencial, las bacterias se volverán moradas/azules o rosadas durante el procedimiento.,

antes de la tinción, la muestra debe montarse y fijarse en los portaobjetos, como se hizo anteriormente en la técnica de tinción simple. Debido a los 2 tintes utilizados en el procedimiento–violeta de cristal y safrinina—así como el decolorante acetona-alcohol, las bacterias caerán en 2 grupos basados en su reactividad gram. Las bacterias Gram positivas retienen la violeta cristalina incluso a través del paso de decoloración: las bacterias gram negativas no retienen la violeta CRISTALINA, se decoloran y luego recogen el tinte de safrinina., Tanto gram + como – se unen al cristal violeta: el paso clave para su diferenciación es la decoloración.

eche un vistazo al diagrama adjunto del procedimiento de tinción y sus efectos sobre el color bacteriano. Durante el paso violeta-yodo cristalino, las moléculas Unidas dentro del peptidoglicano de la pared celular gram + y dentro de la membrana se mantienen firmemente. La acetona-alcohol en realidad hace que las moléculas de peptidoglicano (dispuestas en una celosía) se contraigan, manteniendo así el cristal violetiodina aún más apretado., En la gram-célula, la capa externa de lipopolisacárido de la pared se disuelve por los agentes decolorantes, y debido a que la capa de peptidoglicano es tan delgada en ese grupo de bacterias, la violeta CRISTALINA se lixivia fuera de la pared.

aunque hay una rutina estándar y reactivos establecidos utilizados en esta tinción, cada persona tiene que encontrar un método particular que funcione mejor para ellos., Las muchas variables que pueden afectar a esta tinción son la edad del cultivo, la cantidad de decolorante utilizado, el tiempo de decoloración, el tipo de organismo (las bacterias ácido-rápidas y las esporas no se tiñen bien), el grosor del frotis y el cuidado general del tintorero.

¿Las razones más comunes para las reacciones Gram falsas?

• Algunas especies bacterianas tienden hacia la variable gram, y mostrarán ambos colores aunque la mayoría de las veces gram +.
• Sobre decolorar la mancha, demasiado tiempo.
• utilizando cultivos antiguos (preferiblemente, los cultivos deben tener entre 18 y 48 horas de antigüedad).,

el procedimiento: hecho individualmente

1. tenemos cultivos de E. coli y bacilo para su tinción de Gram. Esto le dará gram + y gram – controls para verificar su procedimiento., Puede usar 2 portaobjetos, 1 para cada bacteria, o puede dividir un portaobjeto por la mitad y frotar cada bacteria en el portaobjeto dividido. También hay preparados, Gram manchado diapositivas de bacterias de diferentes formas y tamaños de bacterias para mirar.
2. haga el frotis bacteriano de caldo, inclinación o plato.
   • Si se toma de un caldo, use 1-2 loopfuls de la solución de caldo.
   • Si se toma de un medio de agar sólido (Placa o inclinación), suspenda el inóculo en una gota de agua en el portaobjetos y mézclelo bien.,
   • extienda la suspensión en el portaobjetos para que cubra un área al menos del tamaño de un níquel, preferiblemente un cuarto.
   • usted podría pensar en marcar el área de frotis con una marca de lápiz de cera circundante para que pueda encontrar el frotis bajo el microscopio fácilmente.
   • coloque un pedazo de cinta en el lado de la mancha para que sepa cuál es el camino hacia arriba.
3. deje que el portaobjetos se seque totalmente al aire antes de continuar con el procedimiento.
4. caliente-fije la diapositiva sosteniendo la diapositiva en un extremo con sus dedos y moviéndola rápidamente hacia adelante y hacia atrás un par de veces sobre la llama.,
5. realice el procedimiento de tinción como se indica a continuación.

el procedimiento de la mancha

• coloque la diapositiva en la capa de la malla de alambre en la tina del tinte.
• inundar el frotis con gotas de cristal violeta, dejando en 1 minuto. Lavar bien con agua.
• inunde el frotis con gotas de yodo de Gram, dejándolo durante 1 minuto. Lavar bien con agua.
• inundar acetona-alcohol rápidamente en la diapositiva, y lavar dentro de 5-10 segundos (desde el comienzo del decolorante añadido). Lavar bien con agua.
• inundar el frotis con gotas de safrinina, dejando durante 1 minuto., Lavar bien con agua.
• seque con papel bibulous antes de colocarlo en el microscopio para verlo.

1. enfóquese en frotis usando lentes de baja potencia, terminando en una inmersión de aceite de 100x. Asegúrese de tener una gota de aceite en la diapositiva antes de girar su objetivo de 100x en su lugar.
2. interprete los resultados usando el siguiente protocolo.

Interpretación

• las bacterias Gram positivas será azul/ morado/ violeta
• las bacterias Gram negativas será la luz de color rosa

1. Identificar las diversas formas y modalidades de bacterias.,
2. limpie sus diapositivas usando el limpiador de diapositivas en los lavabos.
3. mire los portaobjetos preparados de varias bacterias. Verá diferentes formas y arreglos. Devuelva los portaobjetos preparados a las bandejas del Banco.

Varias bacterias diapositivas