A Comparative Study on the Different Staining Methods and Number of Specimens for the Detection of Acid Fast Bacilli

Vol. 95 (6): 855-858, Nov./Dezembro., 2000

Mustafa Ulukanligil+, Gonul Aslan, Sami Tasçi

Departamento de Microbiologia, Universidade de Harran Escola de Medicina, Sanliurfa, Turquia

A presença de bacilos álcool ácido em várias amostras foi analisada comparativamente com Ziehl-Neelsen (ZN) e microscopia de fluorescência (FM) de coloração, a fim de determinar a sensibilidade na detecção de tuberculose (TB). Um total de 465 espécimes obtidos a partir de 295 doentes foram analisados no Hospital da Escola de Medicina da Universidade de Harran entre Março de 1998 e março de 2000. A cultura foi utilizada como método de referência. 68 doentes (23.,1%) foram diagnosticados como tendo tuberculose por cultura. As sensibilidades de coloração ZN e FM foram de 67, 6% (46 / 68) e 85, 2% (58 / 68), respectivamente. Duzentos e um doentes (68,1%) apresentaram uma amostra ao laboratório. Foi detectada positividade da TB em 42 (20, 9%) destes doentes por cultura. Verificou-se que as sensibilidades das manchas de ZN e FM eram de 61% e 83% nestes doentes. No entanto, em 18 doentes (6, 1%) que apresentaram duas amostras ao laboratório, a tuberculose foi positiva em seis deles (33, 3%) e as sensibilidades ZN e FM foram 66% e 83%, respectivamente., Quando três amostras ou mais foram colhidas dos doentes (76 doentes, 25, 8%), a positividade da TB foi determinada em 20 deles (26, 3%) e as sensibilidades foram de 80% e 92% nos esfregaços corados com ZN e FM, respectivamente.

nossos dados indicam que no diagnóstico de TB, FM tem maior sensibilidade do que ZN. Em particular, no caso de uma única amostra, o valor de diagnóstico de FM é bastante significativo. Por conseguinte, é possível concluir que tanto a coloração da ZN como da FM podem ser utilizadas para o diagnóstico da TB quando existem mais de dois espécimes., No entanto, se apenas estiverem disponíveis um ou dois espécimes, é preferível a coloração FM.palavras chave: Mycobacterium tuberculosis – sensitivity-Ziehl Neelsen-fluorescence microscopy

tuberculose (TB) remains a major health problem, with an estimate 8 million new cases and 3 million deaths due to this disease every year around the world (Dixie et al.1993). Trezentos a quatrocentos novos casos são relatados todos os anos em Sanliurfa, Turquia, de uma população de 400.000 (S. urfa tuberculosis dispensary statistics report, 1998)., Vários fatores são responsáveis pelo surto de TUBERCULOSE na região: a deterioração das condições sócio-econômicas, com baixa renda e de educação inadequada, e grande desconhecimento da doença, como mostrado pelo fato de que os pacientes, muitas vezes, parar de tomar o medicamento quando seus sintomas desapareceram. Embora o vírus da imunodeficiência humana seja o principal fator em surtos de tuberculose em lugares como os Estados Unidos e África, é bastante raro no sul da Turquia. (Janda 1997, Sommers et al., 1988) e as directrizes para os laboratórios de mycobacteriologia (Kent & Kubica 1985) sugerem que pelo menos três espécimes, de preferência colhidos em três dias consecutivos, devem ser submetidos ao laboratório para o esfregaço e a cultura ácido-rápido (AFB) por doentes suspeitos de terem tuberculose. A detecção da AFB em esfregaços directos preparados com a concentração de sputa, urina e amostras de outros fluidos corporais tem um valor clínico e epidemiológico considerável e continua a ser o teste de diagnóstico rápido mais utilizado para a tuberculose na maioria dos países em desenvolvimento (Nelson et al. 1998)., Enquanto novas técnicas de diagnóstico radiométrico e molecular foram desenvolvidas e são amplamente utilizadas no mundo desenvolvido (Heifets 1997), estima-se que entre 60% e 70% de todos os casos de tuberculose são diagnosticados por meio de exame de esfregaço de sputum (Guthie et al. 1993). Dois métodos tradicionais de coloração, nomeadamente a microscopia de fluorescência (FM) e o método Ziehl-Neelsen (ZN), estão prontamente disponíveis (Nagpaul 1967). O método ZN tem sido comumente usado em todo o mundo, particularmente nos países em desenvolvimento, devido à sua simplicidade e baixo custo (Guthie et al. 1993)., Vários relatórios (Lempert 1944, Boyd & Marr 1975, Janda 1997) indicaram que FM tem uma maior sensibilidade e economiza tempo quando comparado com o método ZN. Uma desvantagem da técnica FM é que pode às vezes produzir resultados falsos positivos. No entanto, a maioria destes podem ser evitados através da reformulação do esfregaço de acordo com o método ZN para microscopia de luz brilhante (Holst et al. 1959, Heifets 1997).,

no presente estudo, estas duas técnicas foram comparadas em termos de sensibilidade no diagnóstico da tuberculose, e foi examinada a correlação entre sensibilidade e número de amostras colhidas. Além disso, à luz dos nossos resultados e da literatura disponível, tentámos identificar as técnicas adequadas às nossas circunstâncias.,

MATERIAIS E MÉTODOS

RESULTADOS

DISCUSSÃO

MATERIAIS E MÉTODOS

duzentos e noventa e cinco pacientes com suspeita de TB foram encaminhados para nossa clínica (Clínica, Laboratório de Microbiologia, da Universidade de Harran Escola de Medicina do Hospital) e um total de 460 amostras foram coletadas a partir deles, entre Março de 1998 e Março de 2000., Estas amostras consistiam em 430 expecto, 17 urina, 4 lavagem gástrica e 3 amostras de abcesso cervical, 3 fluidos pleurais, 1 fluido peritoneal, 1 amostra de biópsia de gânglios linfáticos cervicais e 1 amostra de sémen. todas as amostras de sputum foram descontaminadas e concentradas usando o procedimento de hidróxido de N acetil-L-cisteína-sódio recomendado pelo Center of Disease Control and Prevention (Kent & Kubica 1985)., O sputum, a urina e outros espécimes foram preparados utilizando o método convencional de centrifugação e os esfregaços foram manchados com manchas de carbolfuchsina (ZN) e Auramina-O (fluorocromo) (Ebersole 1995). O sputum, a urina e outros sedimentos foram inoculados em meios de Lowenstein-Jensen e incubados a 37oC em 5% de CO2 durante até seis semanas (Lambi 1995). A cultura foi utilizada como método de referência e comparada com as técnicas ZN e FM., No registo dos números AFB determinados nos esfregaços corados por microscopia de imersão (ampliação x1000), foi utilizada a seguinte escala de reporte: mais de 9 AFB por campo (4+), 1-9 AFB por campo (3+), 1-9 AFB por campo (3+), 1-9 AFB por 10 Campos (2+), 1-9 AFB por 100 campos (1+). Quando apenas alguns AFB foram detectados em 300 campos, os resultados foram considerados questionáveis. A fim de igualar o número de bacilos observados com FM (ampliação de 400x) ao número de bacilos observados com microscopia de imersão (ampliação de 1000x), os valores foram divididos por 4 (American Thoracic Society 1981).,

RESULTADOS

Duas centenas de pacientes (68.1%) apresentou uma amostra para BAAR exame e em 42 (20.9%), o organismo foi isolado a partir de escarro (40 casos), abscesso material (1 caso) e biópsia de linfonodo material (1 caso). Nestes 42 doentes, 28 amostras de sputum apresentaram resultados positivos com coloração ZN e 38 (37 sputum, 1 abcesso cervical) obtiveram resultados positivos com coloração FM. As sensibilidades da coloração ZN e FM foram de 61% e 83%, respectivamente (p<0,05) (Quadro II).,

observámos que os esfregaços que eram positivos tanto com a ZN como com a FM continham entre 1 a 9 AFB por campos. Os 14 esfregaços positivos, que não foram detectados com esfregaços manchados de ZN, foram detectados bacilos de baixa densidade (1-2 bacilos por 100 campos) em esfregaços manchados de FM. Apenas um resultado falso positivo foi observado com o método FM, por isso, as especificidades da coloração ZN e FM foram encontradas como 100% e 99%, respectivamente.

dezoito (6, 1%) doentes apresentaram duas amostras para o laboratório e em 33, 3% (6 em 18) destes doentes, o organismo foi recuperado em 1 ou 2 das amostras de sputum., Quatro destes resultados produziram resultados positivos com coloração ZN (sensibilidade, 66%) e 5 resultados positivos com coloração FM (sensibilidade, 83%). Dois doentes positivos não foram detectados com base em esfregaços manchados de ZN. Os esfregaços de um paciente, que estavam manchados com MF, continham 3-5 bacilos em cada 30-40 campos, enquanto os esfregaços do outro paciente eram negativos com FM e ZN. Não foi detectado qualquer resultado falso positivo nestes doentes.

três ou mais amostras foram submetidas por 25, 8% dos doentes (76 de 153) e 20 destes doentes (26.,3%) foram diagnosticados como tendo TB por isolamento do organismo em uma ou mais amostras de sputum. Dezasseis deles produziram resultados positivos com coloração ZN (sensibilidade, 80%) e 18 resultados positivos com coloração FM (sensibilidade, 92%). Não foi detectado qualquer resultado falso positivo nestes doentes (Tabela II). foram colhidas dezassete amostras de urina para a análise da AFB, mas nenhuma delas revelou ser positiva em esfregaços ou culturas manchados., Da mesma forma, outros espécimes (3 fluido pleural, 4 lavagem gástrica, 1 fluido peritoneal, 2 amostras de abcesso cervical e 1 espécime de sémen) foram considerados negativos com coloração e cultura de ZN e FM, com exceção de um espécime de abcesso cervical que produziu um resultado positivo com coloração e cultura de FM. Uma amostra de gânglios linfáticos cervicais produziu M. tuberculose apenas em cultura.

DISCUSSÃO

a Turquia é um país em desenvolvimento e a TUBERCULOSE ainda é uma doença comum, principalmente no sudeste do concelho., Em Sanliurfa, uma cidade no sudeste, as condições econômicas ainda são muito pobres e 300-400 novos pacientes com tuberculose são registrados todos os anos. nos últimos anos, foram desenvolvidas várias técnicas radiométricas e moleculares para o diagnóstico da tuberculose. As técnicas radiométricas reduzem o tempo de rotatividade para a AFB. No entanto, não são adequados para esta região da Turquia devido ao seu elevado custo (Heifets 1997). Há pouca Margem de manobra mesmo para a utilização de técnicas moleculares devido aos nossos limitados recursos financeiros. Métodos convencionais como ZN e FM são técnicas rápidas e simples com um custo bastante baixo., Até à data, apenas a ZN foi utilizada para o diagnóstico da tuberculose nesta região. No entanto, tem um baixo nível de sensibilidade em comparação com o método FM. O presente estudo foi a nossa primeira tentativa de usar FM e compará-lo com ZN. num estudo comparativo realizámos a fiabilidade dos métodos FM E ZN no exame dos esfregaços para a AFB. Descobrimos que as especificidades de FM E ZN foram 99% e 100%, e as sensibilidades com uma amostra foram 83% e 61%, respectivamente. Quando o número de amostras foi aumentado, a sensibilidade de ambos os tipos de coloração aumentou., Quando utilizávamos mais de dois espécimes, as sensibilidades eram semelhantes. Portanto, é possível dizer que se tivermos menos de três amostras, a fiabilidade da FM é muito maior do que a da ZN. A menos que tenha sido apresentada mais de uma amostra, o que não era fácil, as condições socioeconómicas e culturais existentes, a FM provou ser mais fiável do que o método ZN. Além disso, uma outra vantagem da FM foi que permitiu a detecção de esfregaços positivos, que foram negligenciados com esfregaços manchados de ZN contendo bacilos de baixa densidade., A utilização de FM aumenta significativamente o valor de diagnóstico do esfregaço, particularmente quando existem bacilos de baixa densidade que podem escapar à detecção em esfregaços manchados de ZN. Os nossos resultados estavam de acordo com os de Guthie et al. (1993), Ba and Rieder (1999), and Pollack and Wieman (1977), who reported that FM appears to be more likely to detect TB in smears which contain low-density bacilli. muitos relatórios (Sommers et al. 1988, Nelson et al., 1998) têm mostrado que mycobacteria pode ser liberado irregularmente a partir dos pulmões, e que é mesmo possível encontrar resultados positivos e negativos no mesmo paciente durante o mesmo período. Assim, é aconselhável que mais de um espécime seja coletado de pacientes suspeitos de ter TB. Alguns outros relatórios (Ozturkeri et al. 1997, Durupinar et al. 1997, Pollock & Wieman 1997) alegou que falsas reações positivas podem ocorrer com FM. Observamos apenas um resultado falso positivo no presente estudo., Além disso, não ocorreram reações falsas positivas em nossa investigação com o método ZN. a nossa prioridade neste estudo foi encontrar um método rápido e rentável para o diagnóstico da tuberculose em Sanliurfa. Concluímos que o método FM é bastante económico em termos de tempo e de despesas e é recomendado para laboratórios que manuseiem grande número de espécimes de sputum. Descobrimos que a FM é mais fiável do que a ZN. No entanto, todo o pessoal que deve examinar amostras de sputum deve familiarizar-se com a FM, a fim de evitar resultados falsos positivos e/ou negativos., Por conseguinte, sugere-se que, até que haja pessoal qualificado para a investigação da AFB, os esfregaços devem ser manchados com ambas as manchas e, em seguida, examinados comparativamente. Após o pessoal do laboratório se familiarizar com o método FM, este método pode ser usado rotineiramente por conta própria.

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