a aprovação Ética, consentimento informado, e local de estudo
Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade do Colorado, Boulder Conselho de Revisão Institucional. A natureza, benefícios e riscos do estudo foram explicados a todos os sujeitos, e seu consentimento informado por escrito foi obtido antes da participação., Todas as medições foram realizadas na University of Colorado Boulder Clinical & Translational Research Center (CTRC) e na Fisiologia Integrativa do Aging Laboratory. O estudo foi registado em ClinicalTrials.gov com o identificador NCT02921659.
participantes do estudo
homens de meia idade e mais velhos e mulheres pós-menopáusicas de 55-79 anos foram recrutados a partir de Boulder Colorado e comunidades vizinhas. Todos os indivíduos estavam livres de doenças clínicas, incluindo doença arterial periférica (Índice de tornozelo-braquial
0.,90) e DCV overt avaliadas por um teste de exercício graduado, painel sanguíneo de base, história médica e exame físico por um médico., Todos os sujeitos demonstraram relacionados com a idade, o comprometimento vascular endothelial function (definidos como uma dilatação através do fluxo de valor <6%) e foram excluídos se exibiam anormal de sangue químicos renal ou da função hepática (definido como 1 desvio padrão fora do intervalo normal), tinha dependência do álcool, descontrolada de doenças da tireóide, obesidade grave (índice de massa corporal >40 kg m−2), ou não foram peso estável por pelo menos 3 meses antes de se inscrever em estudo (definido como >2 kg alteração na massa corporal)., A massa corporal, o IMC, e as circunferências da cintura e do quadril foram medidos por antropometria, e a porcentagem total de gordura corporal foi medida usando absorvometria de raios x de dupla energia (Lunar/prodígio, GE). Os níveis de glicose e colesterol total em jejum, LDL e HDL foram medidos usando testes padronizados no laboratório principal da Universidade de Colorado Boulder CTRC no início e após cada fase de intervenção do estudo.
concepção do estudo, aleatorização e intervenção
o projecto do estudo consistiu num ensaio clínico aleatorizado, em dupla ocultação, controlado com placebo, de 2 × 6 semanas., Os indivíduos ingeriram cloreto de nicotinamida riboside (NIAGEN®; 500 mg, duas vezes por dia; Cromadex, Inc.) e cápsulas de placebo durante 6 semanas, cada uma numa ordem determinada aleatoriamente. Os sujeitos foram randomizados após fornecer consentimento informado e cumprir todos os critérios de inclusão. A aleatorização foi realizada por um membro da equipe de estudo não envolvido na avaliação dos resultados. Os participantes do estudo e os membros da equipa de estudo envolvidos na recolha e análise dos resultados foram cegos para a condição de tratamento. As cápsulas foram consumidas com refeições de manhã e à noite., Os indivíduos abstiveram-se de tomar quaisquer medicamentos de venda livre para 48 h e medicamentos de receita médica para 24 h antes de todos os testes experimentais. Todas as avaliações foram realizadas após um jejum de 12 horas durante a noite, com exceção dos testes da função motora, que foram realizados 2 horas após uma refeição ligeira ou lanche, a fim de garantir que os indivíduos tinham energia suficiente para completar a bateria de teste. Os indivíduos abstiveram-se de consumir álcool ou de fazer exercício vigoroso durante 24 horas e abstiveram-se de tomar comprimidos durante pelo menos 12 horas antes de todas as sessões de teste.,
A avaliação da segurança e tolerabilidade
a adesão à intervenção foi avaliada pela contagem de comprimidos. Indivíduos reportados ao laboratório a cada 2 semanas para receber um novo frasco de cápsulas e para discutir quaisquer questões com tolerabilidade ou AEs emergente do tratamento com um membro da equipe de pesquisa que não estava envolvido na coleta de dados ou análise, a fim de garantir cegamento dos investigadores., Os marcadores clínicos padrão da hematologia, função hepática e renal e lípidos sanguíneos foram analisados usando testes clínicos padronizados no Hospital da Comunidade Boulder e quaisquer resultados sanguíneos anormais foram revisados pelo médico do estudo.
isolamento das células mononucleares do sangue periférico
as células mononucleares do sangue periférico foram isoladas a partir de 35 ml de sangue total colhido em tubos Vacutainer™ revestidos com EDTA. O sangue foi então centrifugado a 400 × g durante 20 minutos e a maioria da camada de plasma (~60%) foi removida para aumentar a eficiência do isolamento PBMC a jusante., O restante da amostra foi lentamente adicionada a uma nova 50 ml tubo cônico contendo 10 ml de Histopaque 1.077 (Greiner Bio-One) e de células mononucleares de camada foi isolado pela densidade-dependente centrifugação a 400 x g por 20 min, lavadas e, em seguida, congelada em 2 ml de PBS a uma temperatura de -80°C.
Materiais
Preparação dos padrões de calibração
de ações Individuais padrões foram preparadas pela dissolução de 10 mg ml−1 em 1:1 metanol:água e, em seguida, combinar para obter um estoque de mistura., A reserva combinada do metabolito NAD+ foi preparada a 100 µg ml – 1 de cada composto e a reserva combinada nucleósido/nucleótido foi preparada a 400 µg ml−1 de cada composto; ambos foram congelados a -20 °C até à sua utilização. A solução-padrão interna foi preparada com 250 µg / ml de adenosina-13C5, trifosfato de adenosina-d4, ribosido duplamente marcado com nicotinamida e 2, 5 µg ml−1 de NaM-13C6 em 1:1 metanol:água., Imediatamente antes da análise de cada lote de amostra, os padrões individuais da curva de calibração foram preparados combinando as existências de NAD+ e nucleósidos/nucleótidos com um rácio de 1:1 e diluindo-as em 1:1 metanol:água para as concentrações necessárias. As concentrações variaram de 0, 025 a 25 µg ml−1 para os metabolitos NAD+ e de 0, 1 a 100 µg ml−1 para nucleósidos/nucleótidos. Padrão interno concentrações em todos os níveis de calibração e amostras foram de 50 µg ml−1 para a adenosina-13C5, adenosina trifosfato-d4 e duplamente rotulado nicotinamida riboside, e de 0,5 µg ml−1 para o NaM-13C6.,
a extracção de metabolitos NAD+ e nucleósidos / nucleótidos
p > Pbmcs congelados (total de 5×10E6 células) foi descongelada no gelo. 500 µl de metanol a frio com gelo 70:30:adicionou-se água juntamente com 20 µl de padrão interno e as amostras foram indexadas a 10 s. centrifugou-se o extracto resultante a 8000 × g durante 5 minutos a 4 °C. o sobrenadante resultante foi transferido para um novo tubo de centrifugação e armazenado em gelo. Ao sedimento restante, adicionaram-se 500 µl de metanol frio gelado e a amostra foi indexada por 10 s para ressuspender o sedimento. A amostra foi então centrifugada a 8000 × g durante 5 minutos a 4 ° C., O sobrenadante inteiro foi removido e combinado com o sobrenadante de 70% de metanol. O sedimento resultante foi reservado e congelado a -70 °C para análise da concentração de proteínas utilizando o ensaio de Bradford. O combinado sobrenadante foram centrifugadas a 18.000 x g por 15 min e o sobrenadante resultante foi transferida para um novo tubo e secas em vácuo, centrífuga, a 55 °C. As amostras secas foram reconstituídos em 100 µl de 1:1 de metanol:água e centrifugado a 18.000 x g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi transferido para uma superfície reduzida atividade amostrador automático frasco para análise.,
CL-MS
HPLC a separação dos metabolitos NAD+ e nucleósidos / nucleótidos foi realizada utilizando um método descrito por Evans et al.59 com pequenas modificações. A separação dos metabolitos NAD+ e nucleósidos/nucleótidos foi realizada numa série de 1200 HPLC de Agilent (Santa Clara, CA) utilizando uma coluna Luna NH2 de 100 × 2 mm 5 µm do Phenomenex (Torrance, CA) operada em modo HILICO. O tampão A consiste em 100% de acetonitrilo e o tampão B consiste em 95,5 água com acetato de amónio de 20 mm ajustado a pH 9,6 com hidróxido de amónio de 20 mm., Dez microlitros da amostra extraído foi analisada utilizando o seguinte gradiente a uma vazão de 0,6 ml por min: gradiente linear de 5 a 100% de B por 6 min, mantenha a 100% B de 6 a 9,5 min, em seguida, 100-5% B de 9,5 a 10,5 min, seguido pelo re-equilíbrio e 5% de B a partir de 10,5 a 14 min. A temperatura da coluna foi mantida a 15 ° C para todo o gradiente. A análise espectrométrica de massa foi realizada em um Agilent 6410 Triple quadrupole espectrômetro de massa em Modo de ionização positiva. O gás de secagem foi de 300 ° C a um caudal de 12 ml por minuto. A pressão do nebulizador foi de 30 psi., A tensão Capilar foi de 4000 V. Os dados relativos aos metabolitos NAD+ e nucleósidos/nucleótidos foram adquiridos no modo MRM utilizando condições optimizadas experimentalmente obtidas pela análise da injecção de fluxo de padrões autênticos (tabela suplementar 5). Os padrões de calibração foram analisados numa gama de concentrações de 0, 25 a 250 ng na coluna para os metabolitos NAD+ e de 1 a 1000 ng na coluna para os nucleósidos/nucleótidos. As curvas de calibração para cada metabolito NAD+ e nucleósido/nucleótido foram construídas utilizando um software de Análise Quantitativa de Masshunter Agilente., Os resultados para as CPSP foram quantitativamente obtidos utilizando as curvas de calibração para obter a concentração na coluna, seguida da normalização dos resultados utilizando a concentração proteica do sedimento reservado da extração de PBMC.
de Avaliações da função cardiovascular
de Repouso da pressão arterial foi medida na posição sentada após, pelo menos, 10 min de descanso tranquilo, usando uma semi-automático da pressão de sangue de dispositivo (Dynamap™ XL, Johnson & Johnson, Arlington, TX, EUA)., Medições foram feitas várias vezes a partir do braço não dominante, com 2 minutos de descanso tranquilo entre as gravações. Foram feitas medições repetidas até se obterem três valores de pressão arterial que se situavam dentro de 5 mmHg um do outro. Estes valores foram então calculados em média para determinar a pressão arterial sistólica e diastólica e a pressão arterial em repouso. Os valores basais da pressão arterial foram obtidos utilizando o protocolo acima descrito em dois dias de teste separados antes do início do primeiro braço de intervenção e foram calculados em média para determinar o estado inicial da pressão arterial (ou seja, normal vs., acima do normal) para análises subsequentes.a rigidez aórtica foi medida utilizando o VP carótida-a-femoral, a avaliação padrão-ouro da rigidez da artéria elástica em seres humanos38. Formas de onda de pressão foram gravadas simultaneamente a partir das artérias carótida e femoral usando tonometria de applanation (Millar Inc., Houston, Texas) como descrito anteriormente pelo nosso laboratório60, 61, 62. O tempo de trânsito da onda de pulso aórtico foi determinado medindo o atraso de tempo entre o pé da carótida e as ondas de pressão femoral usando software de análise LabChart., A PWV foi calculada dividindo a distância entre os dois locais de medição pelo tempo de trânsito aórtico.
a conformidade da artéria carótida foi determinada pela Alteração do diâmetro da artéria carótida comum direita (avaliada utilizando ultra-sonografia de alta resolução, PowerVision 6000, Toshiba) em relação à alteração da pressão arterial carótida (avaliada utilizando tonometria de applanation, Millar Inc., Houston, TX) ao longo do ciclo cardíaco., A pressão carótida foi normalizada para pressão arterial braquial obtida usando um botão automático de pressão arterial (Dynamap™ XL, Johnson & Johnson, Arlington, TX, EUA). O cumprimento foi calculado como o CC = π × DD2 × (ΔD DD−1)/(2 × PP), onde DD é o diâmetro diastólico, ΔD é a mudança no diâmetro e PP é a pressão de pulso arterial, como tem sido descrito previously62,63,64,65.,dilatação dependente do endotélio foi medida como dilatação mediada pelo fluxo da artéria braquial para hiperemia reativa, usando ultrassonografia de alta resolução (PowerVision 6000, Toshiba), como descrito anteriormente 66,67, 68. A febre aftosa foi expressa como a variação percentual (%Δ) em relação ao diâmetro basal.as avaliações da função metabólica foram recolhidas no início e durante a última semana de cada fase de intervenção, a fim de garantir a estabilidade da ingestão calórica., Os resultados foram analisados por um nutricionista registrado usando o sistema de dados nutricionais para Pesquisa (Universidade de Minnesota), Como anteriormente descrito por nosso laboratory67, 69.
taxa metabólica de repouso foi medida por calorimetria indireta (ParvoMedics TrueOne 2400), como descrito anteriormente pelo nosso laboratory70, 71. Os indivíduos descansaram em posição supina durante 45-60 minutos, com um capuz ventilado colocado sobre a cabeça para recolher concentrações de oxigénio expirado (O2) e dióxido de carbono (CO2)., A taxa metabólica e a razão de troca respiratória (RER) foram calculadas em segmentos de 1 minuto e calculadas em média a partir de, pelo menos, 30 minutos de dados estabilizados.a sensibilidade à insulina foi avaliada através da medição da captação de glucose por todo o organismo, estimulada pela insulina, utilizando um teste de tolerância à glucose intravenosa com amostragem frequente modificada e o método de análise do Modelo mínimo, tal como descrito em pormenor noutro lado. A resistência à insulina e a sensibilidade das células beta foram avaliadas utilizando o método homeostase model assessment (HOMA), descrito anteriormente 73.,a avaliação da capacidade de exercício e da função física foi determinada a partir de um teste de exercício da esteira graduado até à exaustão Volátil, utilizando um protocolo Balke modificado, como descrito anteriormente 74. O consumo de oxigênio (VO2) e RER foram medidos usando espirometria de circuito aberto com um sistema de análise Online assistido por computador. A frequência cardíaca e as avaliações do esforço percebido (RPE) também foram medidas ao longo do teste.,a resistência à marcha foi avaliada medindo a distância percorrida durante uma tarefa de 6 minutos a pé num percurso interior de 50 pés (para fora e para trás), como descrito anteriormente 75.
a força muscular e a taxa de desenvolvimento do torque foram quantificadas medindo a força máxima produzida durante uma contração voluntária máxima, e a taxa de desenvolvimento do torque foi medida usando a taxa máxima de desenvolvimento do torque durante uma contração rápida e forçada dos músculos flexor do joelho e extensor, como descrito anteriormente pelo nosso laboratory76. A força do Handgrip foi medida usando um dinamómetro handgrip padrão.,a fatigabilidade das pernas foi avaliada utilizando o desempenho até à falha durante uma tarefa de subida do calcanhar de uma só perna. Os indivíduos foram convidados a realizar uma contracção completa da flexão plantar a cada 2 s até à falência, e o teste foi terminado quando o indivíduo parou voluntariamente devido a desconforto ou incapacidade de atingir pelo menos 50% da flexão plantar máxima sem utilizar extremidades superiores por mais de balance77. O atributo crônico de fadiga também foi avaliado usando um questionário de fadiga e a gravidade da fadiga Escale78.o balanço dinâmico foi avaliado utilizando um teste de passo rápido., O comprimento máximo do degrau foi medido em cada direção (para a frente, para trás, para a esquerda, para a direita), e os alvos foram colocados no chão a 80% do máximo do sujeito com linhas de fita colorida, como descrito anteriormente 79. O desempenho foi quantificado em função do tempo e do número de erros cometidos, em média, durante três ciclos do teste de balanço de passo rápido. Cada rodada consistia de 18 comandos instruindo os sujeitos a avançar com um pé aleatório para uma direção aleatória (ou seja, frente esquerda)., Um erro foi definido como a falha em Avançar completamente para além do alvo, perda de equilíbrio, falha em retornar à posição inicial de partida, tomar vários passos para atingir completamente um alvo, ou pisar com a perna incorreta ou para o alvo errado.
A mobilidade foi avaliada como o tempo para completar uma tarefa de 4 m em marcha (realizada em duplicado à velocidade de marcha preferida dos indivíduos) e o teste sit-to-stand de cinco repetidos (realizado em triplicado), como descrito anteriormente 75,78,80., O teste envolve elevar-se de uma posição sentada numa cadeira de altura padrão cinco vezes, o mais rapidamente possível, sem usar os braços como impulso ou suporte.a destreza Manual foi avaliada como o tempo para completar um teste de prancha de 9 buracos, como descrito anteriormente. Os indivíduos recolhiam pinos lisos e arredondados de um prato e colocavam-nos num tabuleiro, e depois devolviam-nos ao prato o mais rapidamente possível. Duas provas foram completadas com cada mão.,
análises Estatísticas
O tamanho da amostra para este estudo foi suficiente para detectar, no mínimo, 50% de aumento em NAD+ concentração seguintes NR suplementação vs. placebo (tamanho de efeito = 0.7; média de diferença = 7; 1−β = 0.8; α = 0,05), bem como clinicamente relevante melhora no sistema circulatório parâmetro com o menor tamanho de efeito (FMD; diferença média = >1%; tamanho de efeito = 0.86). A estimativa da dimensão do efeito para o NAD+ foi determinada a partir de dados preliminares das concentrações de metabolitos NAD+ em CPSP recolhidas em seres humanos., O tamanho do efeito para a febre aftosa foi determinado a partir das intervenções transversais anteriores do nosso laboratório, demonstrando melhorias na funcionalidade vascular 67. O tamanho necessário da amostra foi determinado em 19 indivíduos. Assumindo uma desistência de 20% (4 indivíduos) e exclusão de 40% devido a falhas de tela (consistente com outros estudos de Intervenção em nosso laboratório usando suplementos dietéticos 81,82), um total de 60 participantes foram consentidos para este estudo. A significância foi estabelecida em α = 0, 006 para todos os resultados secundários para ajustar para testes múltiplos de NR vs., placebo (testes T emparelhados) em cada uma das seguintes nove hipóteses pré-especificadas: (1) nad+ metabolitos, (2) parâmetros cardiovasculares, (3) Hematologia, (4) painel metabólico, (5) perfis lipídicos, (6) balanço energético, (7) controlo glicémico, (8) função motora e (9) desempenho de exercício. Como muitas das medidas dentro de cada hipótese estão correlacionadas umas com as outras (por exemplo, medidas cardiovasculares, tabela suplementar 9), cada grupo de medidas listadas acima foi tratado como um resultado ao ajustar-se para comparações múltiplas., Com excepção das nossas variáveis de resultado primário (nad+ metabolitos: NAD+, Naad, NADP, NaM, NMN), nas quais as inferências foram baseadas num nível alfa não ajustado fixado em 0, 05, todas as inferências de significado são baseadas no nível alfa ajustado de Bonferroni (α = 0, 006).
a intenção deste estudo foi traduzir para o ser humano evidência pré-clínica promissora para a eficácia da suplementação crónica com compostos potenciadores NAD+. Portanto, cada resultado foi testado sob uma hipótese direcional que foi determinada a priori, com base em estudos anteriores relatados na literatura., Por conseguinte, foram utilizados testes de hipótese de uma cauda para comparar os efeitos unidirecionais propostos da suplementação NR vs. placebo nestes resultados. Este método foi recomendado noutros locais para os ensaios clínicos de fase I e II controlados com placebo, nos quais o objectivo é obter uma visão precoce da potencial eficácia de um composto 83.antes da análise, todas as variáveis de resultado contínuo foram avaliadas quanto à normalidade utilizando o teste Shapiro−Wilk e examinando histogramas de frequência individuais para cada resultado., Se uma variável não foi distribuída normalmente, foi logotransformada antes da análise. Se a log-transformation não normalizou os dados, a condição de tratamento foi analisada usando o teste Wilcoxon signed rank não paramétrico. Para cada variável, qualquer sujeito com um valor em falta durante qualquer fase foi excluído dessa análise. Com base na interpretação dos dados primários, foram realizadas análises pós-hoc para comparar a alteração da pressão arterial e da rigidez aórtica entre indivíduos que exibiram pressão arterial normal vs. superior à pressão arterial basal normal, utilizando um teste T de duas caudas não emparelhado., Também explorámos a relação entre as concentrações basais de NAD+ e o aumento global de NAD+ utilizando uma correlação de Pearson. Um período de washout formal não foi incluído no projeto do estudo; no entanto, dado o projeto de crossover, testamos a presença de um efeito de reporte para cada um dos resultados em estudo usando regressão linear modelada com um indicador de ordem de tratamento (não foram observados efeitos de reporte entre as condições). Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software R statistical computing platform (versão 3.2.2) e GraphPad Prism 7.
Deixe uma resposta