Discovery of mitocondrial DNA

Some concepts take the scientific world by storm, but others conquer it only after many skirmishes. A descoberta do DNA mitocondrial (mtDNA) pertence a esta segunda categoria. Biochemists, histologists, and electron microscopists had seen DNA in mitochondria for years, but most of them were not ready for the idea that the DNA really belonged there. Isto pode explicar por que os livros de contas do mtDNA quase nunca dizem como este DNA foi descoberto.,

Após o básico de construção do plano de células eucarióticas tinha sido revelado no início da década de 1950 pelo micrografias eletrônicas de Palade, Sjöstrand, e outros, bioquímicos abraçou de Duve do dogma de que cada macromolécula tinha um, e somente um, localização intracelular. Na análise das fracções celulares, a citocromo oxidase foi utilizada como marcador para a mitocôndria, o fosfato dinucleótido de nicotianamida adenina (NADPH)–a redutase do citocromo C para o retículo endoplasmático e o ADN para o núcleo., Dado este estado de espírito, é fácil entender por que a presença de DNA em frações mitocondriais foi geralmente atribuída à contaminação por fragmentos nucleares. Histoquímicos DNA manchas, como a reação de Feulgen, também manchada kinetoplasts de Tripanossomas e o ‘Nebenkern’ de insetos espermatozóides, mas naquele tempo ainda não era reconhecido que estas estruturas eram, na verdade, incomum mitocôndrias., Quantidades massivas de DNA extranuclear também foram detectadas no citoplasma dos oócitos anfíbios, mas levou muitos anos para perceber que esse DNA era, de fato, mtDNA cuja abundância refletia a enorme quantidade de mitocôndrias nessas grandes células. Em 1961, na Quinta Reunião Anual da American Society of Cell Biology em Chicago, Hans Ris mostrou micrografos de elétrons da mitocôndria com inclusões semelhantes aos nucleoides contendo DNA de bactérias e fez a proposta herética de que as mitocôndrias (e também cloroplastos) contêm seu próprio DNA., Em um artigo publicado no ano seguinte, Ris e Walter s Plaut documentaram e expandiram essas observações. Logo depois, evidências bioquímicas e morfológicas de vários grupos confirmaram a presença de DNA em cloroplastos.a descoberta de ADN de cloroplastos fez com que os bioquímicos revissem os resultados iniciais de Margaret Mitchell e Boris Ephrussi, segundo os quais certas mutações que afectam a função mitocondrial no bolor Neurospora crassa e na levedura Saccharomyces cerevisiae não foram herdadas de acordo com as leis de Mendel., Parecia tentador especular que os “fatores extracromossômicos” desconhecidos implicados nestas mutações eram, de fato, mtDNA.

em 1962, o terreno para o conceito de mtDNA foi, portanto, bem preparado, mas o conceito em si não foi geralmente aceito. Em retrospectiva, parece que a comunidade científica estava esperando por estudos convincentes que documentaram a existência do mtDNA por vários métodos diversos.um destes estudos veio dos microscopistas eletrônicos Margit MK Nass e Sylvan Nass, que estavam então trabalhando no Instituto Wenner Gren da Universidade de Estocolmo., Eles mostraram que a matriz de ósmio-fixo garota embrião mitocôndrias contidas thread-como inclusões cuja aparência após diferentes procedimentos de fixação de perto o paralelo que da histona livre de DNA nucleoid de bactérias: após a fixação com tetróxido de ósmio, o inclusões apareceu aglutinados e como barras com diâmetro de ~400 Å; fixação dos tecidos com tetróxido de ósmio, seguido pelo tratamento com acetato de uranilo antes de desidratação fez aparecer como 15-30-Å finas fibras., Ainda mais convincente evidência para a presença de DNA nessas inclusões foi a observação de que as inclusões poderiam ser removidas tratando o tecido embrionário levemente fixo com DNase. O tratamento com pepsina, com RNase ou com controlos de tampão livres de DNase foi ineficaz. A clareza destes micrografos de elétrons e os controles cuidadosos que foram incluídos tiveram um impacto irresistível nos biólogos celulares. MMK Nass and S Nass published their work in two back-to-back papers in a 1963 issue of the Journal of Cell Biology., Naquela época, no entanto, a biologia celular e a bioquímica ainda eram disciplinas bastante diferentes e a maioria dos bioquímicos não analisavam periódicos dedicados à biologia celular. Por conseguinte, demorou algum tempo até que as conclusões da MMK Nass e da S Nass entrassem na consciência da comunidade bioquímica.

Ao mesmo tempo, Ellen Haslbrunner, Hans Tuppy, e Schatz no Instituto de Bioquímica da Universidade de Viena, estava tentando encontrar uma base bioquímica para a extrachromosomal mutações que aboliu a função respiratória na levedura S. cerevisiae., No início dos anos 1960, muitos bioquímicos ainda estavam relutantes em considerar os “grânulos respiratórios” da levedura como uma mitocôndria de boa fé, que colocou a pesquisa por Haslbrunner et al. bem fora da corrente principal da bioquímica mitocondrial nos Estados Unidos e em outros lugares.para procurar ADN nas mitocôndrias, foi escolhida uma abordagem bioquímica. As mitocôndrias de levedura foram purificadas pelos melhores métodos disponíveis, e seu teor de DNA foi medido pela reação colorida “Diesche”., Alguns anos antes, Duve e colegas de trabalho tinham mostrado que a centrifugação de frações subcelulares para o equilíbrio em um gradiente de densidade muitas vezes dava uma separação limpa de diferentes organelas. Surpreendentemente, o costume de sacarose gradientes de não separar a levedura mitocôndrias a partir de fragmentos nucleares, mas quando a sacarose foi substituído com o X-ray contrastantes agente ‘Urografin’, a mitocôndria formado extremamente afiada banda, e o DNA só esteve presente em duas frações: a maioria estava no fundo do tubo de centrífuga, e uma quantidade muito pequena, mas discreto pico coincidiu exatamente com a da mitocôndria., O ADN na fracção inferior foi facilmente digerido pela DNase e aparentemente representava ADN nuclear. O ADN na fracção mitocondrial não foi facilmente digerido pela DNase a menos que as organelas tenham sido interrompidas pela primeira vez com ácido tricloroacético; presumivelmente, representava ADN incluído pelas membranas mitocondriais. A sua concentração foi muito constante entre diferentes experiências-entre 1 e 4 µg de proteína mitocondrial. A mitocôndria purificada pela urografina proveniente do fígado de rato, rim de rato e coração de bovino continha quase 10 vezes menos ADN, entre 0, 2 e 0, 6 µg de ADN por mg de proteína., O típico mitocôndrio mamífero foi calculado para conter 3 × 10-17 g de ADN. Assumindo que o ADN era de cadeia dupla, não podia codificar mais de 1,2 MDa de cadeias polipeptídicas. Este resultado foi considerado importante, porque excluiu firmemente a possibilidade de que o mtDNA codificou todas as proteínas mitocondriais. Hoje, este cálculo inicial por Haslbrunner et al. pode ser desafiado por vários motivos, mas chegou muito perto da realidade: os 13 polipéptidos codificados por mamífero mtDNA têm uma massa total de 0.,423 MDa, e o restante do potencial de codificação é em grande parte explicado por genes para ribossômicos e RNAs de transferência, bem como pelo fato de que as mitocôndrias geralmente têm mais de uma cópia de seu genoma de DNA.