The gram stain, originally developed in 1884 by Christian Gram, is probably the most important procedure in all of microbiology. Tem de ser um dos procedimentos mais repetidos feitos em qualquer laboratório. Gram estava realmente usando corantes em células humanas, e descobriu que as bactérias preferencialmente ligam alguns corantes. A mancha Gram é uma mancha diferencial, ao contrário da mancha simples que usa 1 Corante. Como resultado do uso de 2 corantes, tornando este procedimento uma mancha diferencial, as bactérias vão se tornar roxo/azul ou rosa durante o procedimento.,antes da coloração, a amostra deve ser montada e fixada nas lâminas, tal como anteriormente feito na técnica de coloração simples. Devido aos 2 corantes utilizados no procedimento-violeta cristal e safrinina-bem como o descolorizador acetona-álcool, as bactérias vão cair em 2 grupos com base em sua reatividade gramatical. As bactérias gram positivas retêm o violeta cristal mesmo através do passo de descoloração: as bactérias gram negativas não retêm o violeta cristal, são descolorizadas e, em seguida, pegar o corante safrinina., Ambos gram + e-ligam-se ao violeta de cristal: o passo chave para a sua diferenciação é a descoloração.
dê uma olhada no diagrama que acompanha o procedimento de coloração e seus efeitos na cor bacteriana. Durante o passo Violeta-iodo cristal, as moléculas ligadas dentro do peptidoglicano da parede celular de gram + e dentro da membrana são mantidas firmemente. A acetona-álcool na verdade faz com que as moléculas de peptidoglicano (dispostas em uma reticework) encolham, segurando assim a violetiodina de cristal ainda mais apertada., Na célula-grama, a camada lipopolissacarídea externa da parede é dissolvida pelos agentes de descoloração, e como a camada peptidoglicana é tão fina nesse grupo de bactérias, o violeta cristal é arrastado para fora da parede.
embora haja uma rotina padrão e reagentes conjuntos usados nesta mancha, cada pessoa tem que encontrar um método particular que funciona melhor para eles., As muitas variáveis que podem afetar esta mancha são a idade da cultura, a quantidade de descoloração utilizada, o tempo de descoloração, o tipo de organismo (bactérias ácidas-rápidas e esporos não mancha bem), a espessura da mancha, e o cuidado geral do mancha.as razões mais comuns para reacções de falsos gram?algumas espécies bacterianas tendem para a variável gram, e mostram ambas as cores, embora na maioria das vezes gram +.sobre a descoloração da mancha, muito tempo.utilizando culturas antigas (de preferência, as culturas devem ter entre 18 e 48 horas de idade).,
Nota
- certifique-se de que o seu esfregaço não é muito espesso: caso contrário, ou os corantes não conseguem penetrar ou as células não serão descolorizadas adequadamente.certifique-se de que cronometra correctamente o passo de descoloração.inundar o esfregaço com um agente descolorizador uniformemente sobre o esfregaço.
materiais necessários
- controlo Gram negativo: E., coli cultura
- Gram-positiva, de controle: Bacillus subtilus cultura
- preparado, comprei slides de várias grama manchado de bactérias
- corantes
- corante mancha banheira de hidromassagem
- fio de sobreposição para banheira de hidromassagem
- limpe as lâminas de microscópio
- óleo de imersão
- blotting paper
O PROCEDIMENTO: feito individualmente
- temos culturas de E. coli e Bacillus para coloração de gram. Isto dar-lhe-á Gram + e gram – controls para verificar o seu procedimento., Você pode usar 2 slides, 1 para cada bactéria, ou você pode dividir um slide ao meio e sujar cada bactéria no slide dividido. Há também lâminas de bactérias preparadas, gram manchadas de diferentes formas e tamanhos de bactérias para olhar.Faça o esfregaço bacteriano a partir de caldo, caldo ou placa.se for tomado de um caldo, utilize 1-2 loopfuls da solução de caldo.se retirado de um meio de ágar sólido (placa ou inclinação), suspender o inóculo numa gota de água na lâmina e misturá-lo bem.,espalhar a suspensão sobre a lâmina de modo a cobrir uma área pelo menos igual à dimensão de um níquel, de preferência um quarto.você pode pensar em marcar a área da mancha com uma marca de lápis de cera circundante para que você possa encontrar a mancha sob o microscópio facilmente.coloque um pedaço de fita no lado da mancha para saber qual o caminho para cima.Antes de prosseguir com o processo, deixar secar totalmente o ar da lâmina.Heat-fix the slide segurando o slide em uma extremidade com os dedos e movendo-o rapidamente para trás e para a frente algumas vezes sobre a chama.,execute o procedimento de coloração conforme indicado abaixo.o procedimento de coloração
- colocar a lâmina na cobertura da malha do fio no tubo corante.inunda a mancha com gotas de violeta de cristal, deixando-a durante 1 minuto. Lave bem com água.inundar a mancha com gotas de iodo de Gram, deixando por 1 minuto. Lave bem com água.acetona-álcool de inundação rapidamente na lâmina, e lavar dentro de 5-10 segundos (a partir do início do descolorizador adicionado). Lave bem com água.inundar a mancha com gotas de safrinin, deixando-a durante 1 minuto., Lave bem com água.antes de colocar no microscópio para ver.
- foco no esfregaço usando lentes de baixa potência, terminando em 100x imersão em óleo. Certifique-se de que você tem uma gota de óleo no slide antes de rodar sua lente objetivo de 100X no lugar.
- interprete os resultados usando o protocolo abaixo.as bactérias Gram positivas serão azuis / roxas/violetas as bactérias Gram negativas serão rosa claro,limpe os seus ‘SLIDES’ usando o limpador de ‘slides’ nos lavatórios.veja as lâminas preparadas de várias bactérias. Você vai ver diferentes formas e arranjos. Devolver os slides preparados para os tabuleiros no banco.
Diversas bactérias slides
DÚVIDAS
- Criticando a sua técnica de coloração de gram:
- São as células bem distribuídas no slide?as células estão manchadas uniformemente e a reacção gram está correcta?,a disposição da bactéria é consistente nos vários campos de visão?Qual é a reacção gram, forma e disposição do Bacillus?Qual é a reacção gram, forma e disposição de E. coli?Qual é a cor da E. coli quando a grama está manchada? Diz O corante que lhe dá esta cor.
- a que estrutura celular se ligam os 2 corantes?listar pelo menos 3 diferenças entre bactérias gram-positivas e gram-negativas.seria útil realizar uma mancha de grama numa cultura mista? Por quê?,se uma mancha de grama lhe der informações valiosas sobre as características da bactéria, qual seria o benefício de alguma vez realizar uma simples mancha?
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