Morfológicas e Biológicas Características de Staphylococcus aureus, o Biofilme Formado na Presença de Plasma

Introdução

o Staphylococcus aureus é um gram-positivo coccus que coloniza a mucosa nasal e pele de indivíduos saudáveis.1 este organismo pode causar uma vasta gama de doenças, desde infecções da pele ou dos tecidos moles até doenças sistémicas e fatais.1-3 em particular, Resistente à meticilina S., aureus (MRSA) é um organismo perigoso devido à sua resistência a múltiplos antibióticos e capacidade de formação de biofilmes. Infecções derivadas do sangue de locais de infecção ou focais são exemplos de casos graves de doenças MRSA. O aparecimento do MRSA adquirido pela comunidade (CA-MRSA), além do MRSA adquirido pelo Hospital convencional (HA-MRSA), representa um risco elevado para os doentes imunocomprometidos e indivíduos saudáveis.

é bem conhecido que as bactérias formadoras de biofilmes podem sobreviver na presença de elevadas concentrações de agentes antimicrobianos.,4 biofilmes bacterianos consistem em uma variedade de componentes e substâncias de ambas as bactérias (polissacárido, peptidoglicano e DNA) e do hospedeiro (detritos celulares, produtos de coagulação e DNA). A composição do biofilme varia dependendo do organismo causador e / ou dos fatores hospedeiros.aureus possui um fator de virulência específico chamado coagulase, que desempenha um papel significativo na formação de biofilmes durante as infecções por S. aureus., A Coagulase liga-se à protrombina hospedeira e forma complexos activos de estafilotrombina, que converte o fibrinogénio monomérico solúvel em fibrina insolúvel auto-polimerizada e activa uma cascata de coagulação.Este fenómeno foi utilizado em laboratórios de Microbiologia Clínica como teste de coagulase para a identificação das espécies de Staphylococcus. Nos últimos anos, alguns relatos sugeriram que S. aureus utiliza a fibrina e o fibrinogénio recrutados pela coagulase para formar o Suporte de biofilme.Relatórios anteriores demonstraram mecanismos de resistência aos antibióticos em bactérias formadoras de biofilmes., Mesmo em condições livres de plasma, as bactérias formadoras de biofilmes apresentam alta resistência a uma variedade de antibióticos. A barreira à acumulação e penetração de antibióticos devido à estrutura do biofilme, além da natureza tolerante e estática das bactérias nos biofilmes, são cruciais para a resistência aos antibióticos em organismos formadores de biofilmes. No entanto, o conhecimento sobre a resistência aos antibióticos comparativa em biofilmes com ou sem plasma é limitado.7, 8

neste estudo, comparamos as características de S. aureus biofilm formado na presença ou ausência de plasma., A análise foi feita sobre duas estirpes de referência que eram representantes do CA-MRSA e do HA-MRSA, respectivamente. Aplicamos a microscopia de reflexão confocal (COCRM) 9 para observar as características morfológicas do biofilme. O COCRM nos permitiu observar continuamente o mesmo biofilm sem adicionar corantes fluorescentes. Finalmente, a resistência aos antibióticos foi comparada nos biofilmes de S. aureus formados com condições sem plasma e adicionadas ao plasma.,

Materiais e Métodos

estirpes Bacterianas e condições de cultura

Duas cepas de MRSA, ATCC BAA1556 (FPR3757 tensão; USA300 clone) e N315 (Nova York/Japão clone), foram utilizados neste estudo.10, 11 estas estirpes foram armazenadas em caldo bhi (Becton Dickinson) com 20% de glicerol a -80°C. antes da utilização, as estirpes foram cultivadas durante a noite em Agar BHI e depois subcultadas durante 12 horas em caldo BHI a 35°C, com agitação a 160 rpm em condições aeróbias., Um mililitro da cultura foi centrifugado a 9.000 × g, e os pellets bacterianos foram suspensos em caldo de soja tríptico (Becton Dickinson) contendo 0,25% de glicose (TSBG). Este passo foi repetido mais uma vez. As concentrações inibitórias mínimas (MICs) de vancomicina, linezolida e rifampicina para ambas as estirpes foram, respectivamente, de 0, 5, 1 e 0, 008 µg/mL. Os microgramas de Daptomicina para BAA1556 e N315 foram de 0, 5 e 0, 25 µg/mL, respectivamente. Os protocolos patógenos foram aprovados pelo Comitê de segurança da Universidade Toho para patógenos (aprovação nº 17-55-58).,

quantificação da formação de biofilmes em placas de 96 alvéolos utilizando o método de coloração violeta cristal

Plasma De Coelho (Eiken Chemical, Tóquio, Japão) foi dissolvido em TSBG e posteriormente diluído com TSBG. As concentrações plasmáticas finais foram ajustadas para um intervalo de 0-12, 5% (v/v). As culturas bacterianas durante a noite foram diluídas para uma OD600 de 0, 01 (106-107 UFC/mL) utilizando plasma contendo TSBG. Cem alíquotas de microlitros foram então inoculadas em poços individuais de uma placa de poliestireno de fundo redondo de 96 poços e incubadas a 35 ° C durante 6-18 horas., Após a incubação, os biofilmes foram quantificados seguindo um método de coloração de violeta cristal previamente relatado, exceto para a utilização de 33,3% de ácido acético em vez de etanol.12

Visualização da estrutura do biofilme em uma base de vidro prato com COCRM

durante A noite de culturas foram diluídas para uma OD600 de 0,01 usando TSBG ou TSBG contendo 7.14% de plasma. As alíquotas de dois mililitros foram inoculadas em pratos à base de vidro (IWAKI, Tóquio, Japão) e incubadas a 35°C por 12 ou 24 horas., Após a incubação, os biofilmes formados na superfície de vidro foram lavados com água, e as estruturas do biofilme foram visualizadas pelo COCRM usando um microscópio de varredura Laser Carl Zeiss (LSM 710) equipado com um plano de abertura numérica de 63 × /1.40-lente objetiva apocromática.9,13 biofilmes e as superfícies de vidro foram iluminadas com laser de argônio de 514 nm, e a luz refletida foi coletada através de um filtro de passagem de banda de 505-530 nm. Como divisor de feixes, um meio espelho NT 80/20 foi usado. Imagens do COCRM foram analisadas com a Carl Zeiss software (ZEN 2011).,

formação de Biofilme em um fluxo de células do sistema

células de Fluxo (IBI Científica, Dubuque, IA) foram constantemente irrigada com meio fresco (TSBG ou TSBG contendo 0.39% de plasma) a utilização de uma bomba peristáltica (Ismatec, Glattbrugg, Suíça).As culturas bacterianas durante a noite foram diluídas para uma OD600 de 0, 01 utilizando TSBG. Quatrocentos alíquotas de microlitros foram então injetados de cada uma das fechaduras de três vias conectadas às extremidades distais das células de fluxo e cultivadas durante 1 hora a 35°C na superfície de vidro das células de fluxo sem fluxo., Após confirmação da adesão inicial utilizando o CACRM, cada meio fluiu a uma velocidade de 0,2 mL / min. Os biofilmes foram incubados durante 24 horas a 35 ° C. A formação de biofilmes foi avaliada pelo COCRM a cada 3 horas.

Efeitos do meio sobre a formação de biofilme em uma base de vidro prato

Nós estabelecemos um protocolo semelhante à célula de fluxo modelo utilizando o vidro pratos para analisar a atividade antimicrobiana contra plasma biofilme, porque o prato de vidro é muito versátil para observar o plasma formação de biofilme. As culturas da noite para o dia foram diluídas para uma OD600 de 0, 01 em TSBG ou TSBG contendo 0.,78% plasma. As alíquotas de dois mililitros foram inoculadas em pratos à base de vidro e incubadas estaticamente a 35°C em condições aeróbias durante 1 hora para permitir a adesão inicial. Este passo permite observar a aderência bacteriana à superfície do vidro por microscopia de reflexão confocal (CRM). Posteriormente, os meios de cultura foram atualizados a cada hora para manter um fornecimento constante de plasma por 6 horas no total. O meio com plasma foi substituído cinco vezes durante 6 horas (a 1, 2, 3, 4 e 5 horas)., Após a incubação, biofilmes formados na superfície de vidro foram lavados com água, e as estruturas de biofilme foram visualizadas pelo COCRM.

a visualização da penetração e acumulação de antibióticos no biofilme, utilizando vancomicina e Daptomicina rotuladas fluorescentes, foi diluída para uma OD600 de 0, 01 em TSBG ou TSBG contendo 0, 78% de plasma. As alíquotas de dois mililitros foram inoculadas em pratos à base de vidro e incubadas a 35°C. Durante 6 horas de incubação, os meios de cultura foram refrescados a cada hora., Após a remoção de bactérias flutuantes por lavagem duas vezes com fosfato tampão salino (PBS), antibióticos fluorescentes marcados (BODIPY-FL-vancomicina ou BODIPY-FL-Daptomicina) foram adicionados aos pratos à base de vidro. BODIPY-FL-vancomicina foi comprada a partir de Invitrogen, enquanto BODIPY-FL-Daptomicina foi sintetizada a partir de éster BODIPY-FL NHS (Invitrogen) e Daptomicina pela Universidade de Toho de Ciências Farmacêuticas. Ambos os antibióticos foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo e depois diluídos com PBS com concentração de iões de cálcio ajustada para 50 mg / L., A concentração final da BODIPI-FL-vancomicina adicionada aos biofilmes foi de 2 µg/mL. A BODIPI-FL-Daptomicina sintetizada mostrou uma fraca intensidade de fluorescência em comparação com a vancomicina, pelo que a concentração final foi ajustada para 20 µg/mL. A permeabilidade de ambos os antibióticos nas estruturas do biofilme foi monitorizada durante 60 minutos utilizando um microscópio laser de Carl Zeiss (LSM 710). Os biofilmes foram iluminados com laser de argônio de 488 nm, e a luz refletida foi detectada com um ganho de 550 nm., Da mesma forma, os corantes BODIPY-FL foram iluminados com laser de argônio de 488 nm, e a fluorescência verde foi detectada para vancomicina e Daptomicina com um ganho de 670 e 600, respectivamente. As imagens em série foram analisadas com um software Carl Zeiss (ZEN 2011).

a determinação Quantitativa do número de bactérias viáveis após a exposição a antibióticos

durante A noite de culturas foram diluídas para uma OD600 de 0,01 usando TSBG ou TSBG contendo de 0,78% de plasma. As alíquotas de dois mililitros foram inoculadas em placas de poliestireno de seis poços e incubadas a 35 ° C., Durante 6 horas de incubação, o meio de cultura foi atualizado a cada hora. Após a remoção de bactérias flutuando, biofilmes foram lavadas duas vezes com TSBG e, em seguida, tratados com 64 × MICROFONE de antibióticos por 12 horas a 35°C. Estes antibióticos foram dissolvidos em TSBG com concentração de cálcio ajustado para 50 mg/L. Apenas a rifampicina foi dissolvido em metanol e, em seguida, diluído com TSBG contendo 50 mg/L de Ca2+. A concentração final de metanol foi de 500 µL/mL. Neste experimento, TSBG contendo 50 mg / L de Ca2+ e metanol foram usados como controle de caldo., As bactérias flutuantes foram removidas após o tratamento, e os biofilmes foram lavados duas vezes com solução salina. Dois mililitros de proteinase K (0, 1 mg/mL; WAKO, Osaka, Japão) dissolvidos em PBS foram usados para afrouxar as estruturas de biofilme. Os biofilmes tratados com Proteinase K foram descascados com um raspador.15 as suspensões de biofilme foram colocadas suavemente a 37 ° C durante 30 minutos e depois diluídas com solução salina e revestidas com ágar nutriente para contar o número de bactérias incorporadas no biofilme. Após o crescimento a 35 ° C, as colônias foram contadas.

ensaio de viabilidade bacteriana viva/morta

, aureus biofilm com ou sem plasma após tratamentos com diferentes agentes anti-MRSA foi realizado. As culturas da noite para o dia foram diluídas para uma OD600 de 0, 01 em TSBG ou TSBG contendo 0, 78% de plasma. Em seguida, 200 µL alíquotas foram inoculados em câmara de vidro de oito poços (IWAKI) e incubados a 35°C. os meios de comunicação foram atualizados a cada hora durante 6 horas. Após a remoção de bactérias flutuantes, os biofilmes foram lavados duas vezes com TSBG, e depois tratados com 64 × MIC de antibióticos durante 12 horas a 35°C. estes antibióticos foram dissolvidos em TSBG com uma concentração de Ca2+ ajustada para 50 mg / L., A rifampicina foi dissolvida em metanol e depois diluída com TSBG contendo 50 mg/L. A concentração final de metanol foi de 500 µL/mL. Neste experimento, TSBG contendo 50 mg / L de Ca2+ e metanol foram usados como controle de caldo. Bactérias flutuantes foram removidas após o tratamento. A viabilidade bacteriana no biofilme foi determinada pelo kit de viabilidade Biofilm FilmTracer™ LIVE/DEAD® (sondas moleculares). As células viáveis eram manchadas com SYTO 9 (verde), enquanto as bactérias mortas eram manchadas com iodeto de propídio (vermelho)., Após o tratamento, as bactérias suspensas foram removidas e manchadas com solução de coloração viva/morta durante 20 minutos. Após coloração, o sobrenadante foi removido e lavado duas vezes com água pura, e depois a actividade bactericida do agente antibacteriano foi visualmente avaliada através de um microscópio de varrimento a laser confocal.

análise estatística

os resultados analisados utilizando Prism 5.0 da GraphPad são apresentados como valor médio ± desvio-padrão. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando o valor p foi <0, 05., Os resultados de experiências quantitativas realizadas em figos. 1 e 6 foram analisados por análise de variância (ANOVA) com um teste de Tukey.

Resultados

Efeitos de plasma na formação de biofilme de S. aureus

Nós examinadas de formação de biofilme em diferentes concentrações de plasma para duas cepas de S., aureus, BAA1556 e N315. Em ambas as estirpes, a presença plasmática mesmo em concentrações baixas (0, 09%) induziu um aumento na formação de biofilme após 6 horas de incubação (Fig. 1). Na estirpe BAA1556, observou-se um aumento dependente da concentração na formação de biofilm a partir de 3, 12% no plasma, tendo sido observado um crescimento substancial às 12 e 18 horas. Na estirpe N315, observou-se um aumento de mais de três vezes na formação de biofilme de 6 a 12 horas na ausência de plasma, sem diferença entre 0% e 0, 09% de plasma às 12 horas., Pelo contrário, observou-se uma tendência de redução gradual da massa do biofilme, dependente da concentração, na estirpe N315, a partir de 0,78% ou mais de concentração plasmática.

características Morfológicas de biofilme de S. aureus na presença de plasma

S. aureus biofilme foi formado após estático de incubação na presença ou ausência de plasma, e a microestrutura do biofilme foi comparada COCRM. Como mostrado na Fig. 2, formou-se um biofilme uniforme e plano na ausência de plasma em ambas as estirpes BAA1556 e N315., Em contraste, observou-se biofilme desigual e estruturado agregado na presença de plasma em ambas as estirpes. A morfologia microscópica do biofilme de S. aureus formado na presença de plasma era distintamente diferente das formadas sem plasma e, portanto, estas são adiante referidas como biofilme plasmático.

S. aureus formação de biofilme no fluxo de célula condição na presença de plasma

O fluxo de célula do sistema, o que representa um clinicamente relevantes condição, foi utilizado para observar o efeito da contínua de plasma de abastecimento de formação de biofilme., Comparamos os primeiros pontos temporais da formação de biofilme na célula de fluxo na presença ou ausência de plasma pelo COCRM (Fig. 3). Sem plasma, a ligação de poucas bactérias foi observada após 3 horas de incubação. Em contraste, foram observados agregados de formação de biofilme na presença de plasma em ambas as estirpes de S. aureus. A estrutura deste biofilm plasmático após 3 horas no sistema de células de fluxo foi semelhante ao biofilm plasmático em estado estático às 12 horas(Fig. 2)., No entanto, no estado das células de fluxo, o descolamento do biofilme plasmático agregado foi observado em momentos posteriores de incubação (dados não apresentados).

a Penetração e a acumulação de vancomicina em biofilme de S. aureus

O BAA1556 e N315 cepas foram incubadas em TSBG médio, na presença ou ausência de 0,78% de plasma. O meio de cultura foi atualizado a cada hora durante 6 horas. Na condição de controlo, a estrutura do biofilme com ou sem plasma foi examinada pelo COCRM (Fig. 4-i). Em seguida, a vancomicina verde marcada com fluorescência foi adicionada à cultura, e o biofilme foi observado por mais uma hora., A penetração e acumulação da vancomicina foram comparadas na presença ou ausência de plasma por microscopia de varrimento a laser confocal. Como esperado, observaram-se diferenças marcantes nas estruturas de biofilme entre as amostras com ou sem plasma. A adição de vancomicina fluorescente verde enfatizou ainda mais as diferenças entre os biofilmes com ou sem plasma. No biofilme livre de plasma, observou-se a distribuição difusa de fluorescência verde em ambas as estirpes., Em contraste, no biofilme cultivado na presença de plasma (Fig. 4-ii). No biofilme de S. aureus em estado livre de plasma, a difusão e a forte fluorescência verde foram observadas 5 minutos após a administração da vancomicina, que se intensificou em pontos temporais posteriores. Em contraste, o biofilme plasmático exibiu diferentes características de coloração em ambas as estirpes de S. aureus., Observou-se pouco fluorescência verde no biofilme plasmático aos 5 minutos e, posteriormente, a acumulação de fluorescência verde aumentou gradualmente. Estes dados demonstram um atraso na penetração e acumulação da vancomicina no biofilm plasmático, em comparação com o biofilm sem plasma (Fig. 4-iii).

de Avaliação de acúmulo de daptomicina em S. aureus biofilme ao longo do tempo

Nós utilizado verde marcado por fluorescência daptomicina e examinou a penetração e a acumulação de daptomicina em S. aureus biofilmes. Uma vez que a intensidade de fluorescência da Daptomicina era mais fraca do que a da vancomicina, uma maior concentração de Daptomicina foi utilizada no experimento., No biofilme formado na ausência de plasma, fluorescência verde foi visível de 10 a 20 minutos, e depois disso, a intensidade de fluorescência aumentou de forma dependente do tempo para ambas as estirpes de S. aureus. Inversamente, a fluorescência verde dificilmente foi detectável no biofilme plasmático, mesmo após 60 minutos de incubação (Fig. 5). Estes dados sugerem que retardou a penetração e acumulação da Daptomicina no biofilm plasmático, em comparação com o biofilm sem plasma., Infelizmente, não pudemos comparar os dados entre a vancomicina e a Daptomicina, devido às diferenças nas intensidades de fluorescência verde dos antibióticos.

Efeito de antibióticos em bactérias quantidade de biofilme formado com ou sem plasma

Nós comparamos a atividade bactericida de antibióticos em biofilme formado com ou sem plasma. Antes do tratamento, foram recuperadas contagens de células bacterianas semelhantes a partir de biofilmas sem plasma e plasma., Este resultado sugere que a quantidade de formação BF aumentou proporcionalmente à Extensão da acumulação do componente extracelular, incluindo a proteína do fator de coagulação, mas independentemente do número de células bacterianas aderentes. Antibióticos anti-MRSA vancomicina, Daptomicina ou linezolida, com rifampicina reduzida no biofilme sem plasma. No entanto, os biofilmes plasmáticos de ambas as estirpes de S. aureus foram geralmente mais resistentes aos antibióticos, mesmo em associação com rifampicina., Para o BAA1556 tensão, nenhuma condição induzida por mais de dois registo de redução bacteriana número, considerando que o N315 deformação mostraram uma redução significativa no bacteriana número de plasma de biofilme na presença de rifampicina, vancomicina com a rifampicina, e daptomicina com rifampicina (Fig. 6). Estes resultados sugerem que os biofilmes plasmáticos são mais resistentes à actividade bactericida dos antibióticos anti-MRSA examinados. Também fizemos coloração de viabilidade para diferenciar células vivas e mortas nas amostras acima., Alguns resultados de coloração foram consistentes com o número de bactérias, mas houve várias discrepâncias entre a coloração e contagens bacterianas (Figo suplementar. S1).

o método de discussão

CACRM foi, pela primeira vez, aplicado para a observação de S. aureus biofilm, que mostrou o rápido crescimento de biofilmes na presença de plasma. Foram também observados atrasos na penetração ou acumulação de antibióticos e resistência à actividade bactericida de agentes anti-MRSA no biofilme plasmático., Estes resultados sugerem que o biofilm plasmático é substancialmente diferente morfologicamente e biologicamente do biofilm isento de plasma.tal como demonstrado na Fig. 1, a presença de formação de biofilme plasmático potenciado às 6 horas em ambas as estirpes de S. aureus, mesmo numa concentração plasmática tão baixa como 0, 09%. Em pontos temporais posteriores, a formação de biofilme foi aumentada para a estirpe BAA1556 na presença de 3, 12% ou mais de plasma, mas não para a estirpe N315. Inversamente, observou-se uma tendência de redução da massa do biofilme para a estirpe N315 em concentrações plasmáticas mais elevadas., Uma vez que o método de coloração de violeta cristal avalia a ligação do biofilme aos poços de microplacas, é provável que o descolamento do biofilme e a nova formação de biofilme possam refletir a massa total do biofilme. Nós, portanto, observamos a dispersão ou descolamento do biofilme no sistema de células de fluxo e através de incubação estática, especialmente em concentrações mais elevadas de plasma nos pontos de incubação posteriores (dados não mostrados).,

no sistema de células de fluxo observado pelo COCRM, biofilm agregado foi observado em 3 horas após a incubação, o que foi semelhante a 12 horas de incubação do biofilm plasmático na condição estática. Um fornecimento contínuo de plasma provavelmente imita mais de perto o ambiente in vivo, o que poderia acelerar a formação de biofilmes no sistema de células de fluxo. O COCRM é uma técnica recentemente desenvolvida, 13 que nos permitiu observar o curso Temporal de maturação e descolamento de biofilmes sem usar corantes fluorescentes., Portanto, o COCRM pode ser usado como uma ferramenta poderosa para analisar o mecanismo de formação de biofilm e avaliar potenciais estratégias terapêuticas na pesquisa de biofilm.observaram-se diferenças significativas entre a vancomicina e a Daptomicina entre o biofilme sem plasma e o biofilme sem Plasma. Jefferson et al. reported that while vancomicina binds to free-floating bacteria in water within 5 minutes, it took more than 1 hour to bind cells within the deepest layers of a plasma-free biofilm.,Em experiências de biofilme sem plasma, em concentrações terapêuticas de vancomicina, a matriz de biofilme não foi um obstáculo à difusão da vancomicina.No entanto, quando foram utilizados alvéolos revestidos a plasma humano, observou-se transitoriamente um aumento da susceptibilidade ao fármaco na fase inicial (≤24 horas), enquanto que os biofilmes mais antigos e densos exibiam um elevado nível de resistência nos pontos temporais posteriores (>48 horas).6 Cardile et al. demonstrou que a exposição de S., aureus ao plasma resultou num aumento significativo dos componentes microbianos da superfície e os biofilmes aumentados pelo plasma mostraram uma maior tolerância à vancomicina em comparação com o biofilme cultivado em meios sem plasma.7 Além disso, no modelo de rato de infecções do enxerto vascular prostético, a Daptomicina foi ineficaz na erradicação dos biofilmes, porque a matriz agiu como um escudo para a difusão de antibióticos.Estes resultados sugerem que S., aureus biofilm-related resistance or tolerance to anti-MRSA agents could be related to multiple factors, such as the presence of plasma, time of incubation, change in bacterial surface structure, and strain differences.observou-se redução da actividade bactericida com os antibióticos anti-MRSA no biofilm plasmático, em comparação com o biofilm sem plasma em ambas as estirpes. Embora a quantidade de formação de biofilme tenha aumentado na presença de plasma, o número de bactérias não aumentou., Pensa-se que o aumento da formação de biofilmes obtida utilizando componentes plasmáticos interfere com a actividade do agente antimicrobiano. Na estirpe N315, a adição de rifampicina aumentou a actividade bactericida da vancomicina e Daptomicina, mas o seu efeito foi fraco com a estirpe BAA1556. Embora o presente estudo analisou duas diferentes cepas de CA-MRSA (BAA1556) e HA-MRSA (N315), é necessário examinar mais de cepas para uma melhor compreensão das diferenças de tensão e mecanismos de resistência e identificar terapêutico eficaz combinações de plasma de biofilme.,neste estudo, usámos plasma de coelho para analisar o biofilm plasmático. No entanto, o plasma humano deve ser utilizado para clarificar o comportamento real do biofilme plasmático no corpo humano. Além disso, o plasma foi utilizado em concentrações baixas (0, 39 − 7, 14%) Porque o plasma em concentrações elevadas provoca a coagulação do meio pela coagulase do MRSA, o que dificulta a avaliação do biofilme plasmático. Contudo, foi confirmado um aumento significativo da quantidade de formação de biofilme nestas condições de proteína reduzida do factor de coagulação, em comparação com o sangue., Um sistema de coagulação pode ser ativado in vivo e, portanto, estudos adicionais para investigar condições mais próximas do corpo humano são necessários no futuro.em conclusão, reportámos os efeitos do plasma na formação de biofilme de CA-MRSA e HA-MRSA. Os dados mostram que o plasma é um fator crucial para determinar não só a massa do biofilme em si, mas também a natureza biológica do biofilme, incluindo sensibilidade à penetração ou acumulação de antibióticos e resistência aos medicamentos anti-MRSA., Estes resultados enfatizam ainda mais a importância dos biofilmes plasmáticos na compreensão dos obstáculos associados à erradicação e tratamento em ambientes de cabeceira. Os biofilmes de Plasma formados no modelo de células de fluxo podem representar uma condição experimental clinicamente relevante, e a aplicação do COCRM facilita uma análise mais aprofundada dos mecanismos de formação de biofilmes e permite o rastreio de novas estratégias para combater as infecções pelo MRSA.