Etice aprobare, consimțământ informat, și de a studia locație

Toate procedurile au fost aprobate de către Universitatea din Colorado Boulder Institutional Review Board. Natura, beneficiile și riscurile studiului au fost explicate tuturor subiecților, iar consimțământul lor informat în scris a fost obținut înainte de participare., Toate măsurătorile au fost efectuate la Universitatea din Colorado Boulder Clinice & Translațională Centrul de Cercetare (CTRC) și în Fiziologie Integrativă de Imbatranire Laborator. Studiul a fost înregistrat pe ClinicalTrials.gov sub identificatorul NCT02921659.

participanții la studiu

bărbații de vârstă mijlocie și mai în vârstă și femeile aflate în postmenopauză în vârstă de 55-79 de ani au fost recrutați din Boulder Colorado și din comunitățile înconjurătoare. Toți subiecții nu au prezentat boli clinice, inclusiv boală arterială periferică (indice gleznă-brahial >0.,90) și CVD evident, așa cum a fost evaluat printr-un test de exercițiu gradat, panou de sânge de bază, istoric medical și examen fizic de către un medic., Toți subiecții au demonstrat legate de vârstă deficiențe în funcția endoteliului vascular (definit ca un flux-mediată dilatarea valoare <6%) și au fost excluse dacă au expus anormale de sange biochimice pentru renală sau hepatică (definit ca 1 abatere standard în afara intervalului normal), a dependentei de alcool, necontrolat, boli tiroidiene, obezitate severă (indicele de masă corporală >40 kg m−2), sau nu au fost in greutate stabilă pentru cel puțin 3 luni înainte de înrolarea în studiu (definite ca >2 kg schimba în masă corporală)., Masa corporală, IMC și circumferințele taliei și șoldului au fost măsurate prin antropometrie, iar procentul total de grăsime corporală a fost măsurat folosind absorbțiometria cu raze X cu dublă energie (Lunar/Prodigy, GE). Glicemia à jeun și total, LDL și HDL-colesterol au fost măsurate prin teste standardizate de la Universitatea din Colorado Boulder CTRC Laborator de Bază la momentul inițial și după fiecare intervenție faza de studiu.

proiectarea studiului, randomizarea și intervenția

designul studiului a constat într-un studiu clinic încrucișat randomizat, dublu-orb, controlat cu placebo, de 2 × 6 săptămâni., Subiecții au ingerat clorură de ribozidă nicotinamidă (NIAGEN®; 500 mg, de două ori pe zi; ChromaDex, Inc.) și capsule placebo timp de 6 săptămâni fiecare într-o ordine determinată aleatoriu. Subiecții au fost randomizați după furnizarea consimțământului informat și îndeplinirea tuturor criteriilor de includere. Randomizarea a fost efectuată de un membru al echipei de studiu care nu a fost implicat în evaluarea rezultatelor. Participanții la studiu și membrii echipei de studiu implicați în colectarea și analiza rezultatelor au fost orbiți de starea de tratament. Capsulele au fost consumate cu mese dimineața și seara., Subiecții s-au abținut de la a lua orice medicamente fără prescripție medicală timp de 48 de ore și medicamente pe bază de prescripție medicală timp de 24 de ore înainte de toate testele experimentale. Toate evaluările au fost efectuate după un post de 12 ore peste noapte, cu excepția testelor funcției motorii, care au fost efectuate la 2 ore după o masă ușoară sau o gustare pentru a se asigura că subiecții au avut suficientă energie pentru a finaliza bateria de testare. Subiecții s-au abținut să consume alcool sau să se angajeze în exerciții fizice viguroase timp de 24 de ore și s-au abținut să ia pastile de studiu timp de cel puțin 12 ore înainte de toate sesiunile de testare.,

evaluarea siguranței și tolerabilității

aderența la intervenție a fost evaluată prin numărul de pilule. Subiecții raportați la laborator la fiecare 2 săptămâni pentru a primi o nouă sticlă de capsule și pentru a discuta orice probleme cu tolerabilitatea sau AEs emergente cu un membru al echipei de cercetare care nu a fost implicat în colectarea sau analiza datelor pentru a asigura orbirea investigatorilor., Markerii clinici Standard ai hematologiei, funcției hepatice și renale și lipidelor din sânge au fost analizați folosind teste clinice standardizate la Boulder Community Hospital și orice rezultate anormale ale sângelui au fost revizuite de medicul de studiu.

izolarea celulelor mononucleare din sângele periferic

PBMCs au fost izolate din 35 ml de sânge integral colectat în tuburile Vacutainer™ acoperite cu EDTA. Sângele a fost apoi centrifugat la 400 × g timp de 20 min și majoritatea stratului de plasmă (~60%) a fost îndepărtat pentru a crește eficiența izolației pbmc din aval., Restul de probă se adaugă încet la un nou 50 ml tub conic, care conține 10 ml de Histopaque 1.077 (Greiner Bio-One) și mononucleare strat de celule a fost izolat de densitate dependente de centrifugare la 400 × g timp de 20 min, se spală și apoi congelate în 2 ml de PBS la -80°C.

Materiale

Prepararea standardelor de calibrare

stoc Individuale standarde au fost preparate prin dizolvarea a 10 mg ml−1 în 1:1 metanol:apă și apoi se combină pentru a obține un stoc de amestec., Stocul combinat nad + metabolit a fost preparat la 100 µg ml-1 din fiecare compus, iar stocul combinat nucleozidic/nucleotidic a fost preparat la 400 µg ml−1 din fiecare compus; ambele au fost congelate la -20 °C până la utilizare. Soluție standard intern a fost întocmit la 250 µg/ml adenozin-13C5, adenozin trifosfat-d4, de două ori etichetat nicotinamida riboside și 2,5 µg ml−1 din NaM-13C6 în 1:1 metanol:apă., Imediat înainte de analiza fiecărui lot de probă, s-au pregătit standardele individuale ale curbei de calibrare prin combinarea stocurilor nad+ și nucleozide/nucleotide la un raport de 1:1 și apoi diluarea acestora în 1:1 metanol:apă la concentrațiile necesare. Concentrațiile au variat între 0, 025 și 25 µg ml−1 Pentru metaboliții NAD+ și între 0, 1 și 100 µg ml−1 pentru nucleozide/nucleotide. Standard intern concentrații în toate calibrare niveluri și probele au fost 50 µg ml−1 pentru adenozin-13C5, adenozin trifosfat-d4 și de două ori etichetat nicotinamida riboside, și 0,5 µg ml−1 pentru NaM-13C6.,

extracția metaboliților NAD+ și a nucleozidelor/nucleotidelor

Pbmc congelate (celule 5×10e6 total) au fost dezghețate pe gheață. 500 µl de gheață rece 70:30 metanol:apă s-au adăugat de-a lungul cu 20 µl de standard intern și probe vortexed timp de 10 s. Extractul rezultat a fost centrifugat la 8000 × g timp de 5 min la temperatura de 4 °C. rezultă supernatantul a fost transferat la un nou tub de centrifugă și stocate pe gheață. La peleta rămasă s-au adăugat 500 µl de metanol rece ca gheața, iar proba a fost vortexată timp de 10 secunde pentru a omogeniza peleta. Eșantionul a fost apoi centrifugat la 8000 × g timp de 5 minute la 4 °C., Întregul supernatant a fost îndepărtat și combinat cu supernatantul de metanol 70%. Peletul rezultat a fost rezervat și congelat la -70 °C pentru analiza concentrației de proteine utilizând testul Bradford. Combinate supernatantele au fost centrifugate la 18.000 × g timp de 15 min și rezultate supernatantul a fost transferat la un nou tub și se usucă în vid se centrifughează la 55 °C. probele uscate au fost reconstituite în 100 µl de 1:1 metanol:apă și se centrifughează la 18.000 × g timp de 10 min la temperatura de 4 °C. supernatantul A fost apoi transferat la o suprafață redusă activitate autosampler flacon pentru analiză.,

LC-MS

separarea HPLC a metaboliților NAD+ și a nucleozidelor / nucleotidelor a fost efectuată utilizând o metodă descrisă de Evans et al.59 cu modificări minore. Separarea de NAD+ metaboliți și nucleozide/nucleotide a fost efectuat pe un seria 1200 HPLC de la Agilent (Santa Clara, CA) folosind 100 × 2 mm 5 µm Luna NH2 coloana din Phenomenex (Torrance, CA) operate în HILIC modul. Tamponul A a constat din acetonitril 100%, iar tamponul B a constat din apă 95:5 cu acetat de amoniu 20 mm ajustat la pH 9,6 cu hidroxid de amoniu 20 mm., Zece microlitri a extras eșantionul a fost analizat folosind următoarele gradient la un debit de 0,6 ml / min: gradient liniar de la 5 la 100% B peste 6 min, țineți la 100% B de la 6 la 9, 5 min, apoi 100-5% B de la 9,5 la 10,5 min, urmată de re-echilibrare de la 5% B de la 10,5 la 14 min. Temperatura coloanei a fost menținută la 15 °C pentru întregul gradient. Analiza spectrometrică de masă a fost efectuată pe un spectrometru de masă triplu quadrupol Agilent 6410 în regim de ionizare pozitivă. Gazul de uscare a fost de 300 °C la un debit de 12 ml pe minut. Presiunea nebulizatorului a fost de 30 psi., Tensiunea capilară a fost de 4000 V. datele pentru metaboliții NAD+ și nucleozidele / nucleotidele au fost obținute în modul MRM utilizând condiții optimizate experimental obținute prin analiza injecției în flux a standardelor autentice (tabelul suplimentar 5). Standardele de calibrare au fost analizate într-un interval de concentrații de la 0,25 la 250 ng pe coloană pentru metaboliții NAD+ și de la 1 la 1000 ng pe coloană pentru nucleozide/nucleotide. Curbele de calibrare pentru fiecare metabolit NAD+ și nucleozidă/nucleotidă au fost construite utilizând software-ul de analiză cantitativă Agilent Masshunter., Rezultatele pentru Pbmc au fost cuantificate folosind curbele de calibrare pentru a obține concentrația pe coloană, urmată de normalizarea rezultatelor folosind concentrația proteică a peletei rezervată din extracția PBMC.

evaluări ale funcției cardiovasculare

tensiunea arterială în repaus a fost măsurată în poziția așezată după cel puțin 10 minute de odihnă liniștită folosind un dispozitiv de tensiune arterială semi-automat (Dynamap™ XL, Johnson& Johnson, Arlington, TX, SUA)., Măsurătorile au fost făcute de mai multe ori de la brațul non-dominant, cu 2 minute de odihnă liniștită între înregistrări. S-au efectuat măsurători repetate până când s-au obținut trei valori ale tensiunii arteriale care se aflau la o distanță de 5 mmHg una de cealaltă. Aceste valori au fost apoi medii pentru a determina tensiunea arterială sistolică și diastolică în repaus și presiunea pulsului. Valorile inițiale ale tensiunii arteriale au fost obținute utilizând protocolul descris mai sus în două zile de testare separate înainte de inițierea primului braț de intervenție și au fost medii pentru a determina statusul tensiunii arteriale inițiale (adică normal vs., peste normal) pentru analize ulterioare.rigiditatea aortică a fost măsurată utilizând PWV carotidă-femurală, evaluarea standard de aur a rigidității arterei elastice la om38. Formele de undă de presiune au fost înregistrate simultan din arterele carotide și femurale folosind tonometria applanation (Millar Inc., Houston, Texas) așa cum a fost descris anterior de laboratorul nostru60,61,62. Timpul de tranzit al undei pulsului aortic a fost determinat prin măsurarea timpului de întârziere între piciorul undelor de presiune carotide și femurale folosind software-ul de analiză LabChart., PWV a fost calculat prin împărțirea distanței dintre cele două locuri de măsurare la timpul de tranzit aortic.conformitatea arterei carotide a fost determinată de modificarea diametrului arterei carotide comune drepte (evaluată folosind ultrasonografie de înaltă rezoluție, PowerVision 6000, Toshiba) în raport cu modificarea tensiunii arteriale carotide (evaluată folosind tonometria applanation, Millar Inc., Houston, TX) de-a lungul ciclului cardiac., Presiunea carotidiană a fost normalizată la presiunea arterei brahiale obținută folosind o manșetă automată a tensiunii arteriale (Dynamap™ XL, Johnson & Johnson, Arlington, TX, SUA). Conformitatea a fost calculat ca CC = π × DD2 × (ΔD DD−1)/(2 × PP), unde DD este diastolice diametru, ΔD este schimbarea în diametru și PP este pulsul arterial, presiunea, așa cum a fost descris previously62,63,64,65.,

Endoteliu dependente dilatarea a fost măsurată ca artera brahiala flux-mediată de dilatare (FMD) la hiperemia reactivă, folosind de înaltă rezoluție ultrasonografia (PowerVision 6000, Toshiba) anterior described66,67,68. FMD a fost exprimată ca modificare procentuală (%Δ) față de diametrul inițial.evaluările funcției metabolice au fost colectate la momentul inițial și în ultima săptămână a fiecărei faze de intervenție pentru a asigura stabilitatea aportului caloric., Rezultatele au fost analizate de un dietetician înregistrat folosind sistemul de date nutriționale pentru Cercetare (Universitatea din Minnesota), așa cum a fost descris anterior de laboratorul nostru67, 69.

rata metabolica de Repaus a fost măsurată prin calorimetrie indirectă (ParvoMedics TrueOne 2400) după cum este descris anterior de către noastră laboratory70,71. Subiecții s-au odihnit într-o poziție în sus timp de 45-60 de minute, cu o capotă ventilată plasată peste cap pentru a colecta concentrații de oxigen expirat (O2) și dioxid de carbon (CO2)., Rata metabolică și raportul de schimb respirator (RER) au fost calculate pe segmente de 1 min și au fost calculate în medie pe cel puțin 30 min din datele constante.

sensibilitatea la Insulină a fost evaluată prin măsurarea insulină stimulată întregului corp absorbția de glucoză folosind o modificare frecvent incluse în eșantion intravenoasă test de toleranță la glucoză și Modelul Minimal Metoda de analiză descrisă în detaliu elsewhere72. Rezistența la insulină și sensibilitatea celulelor beta au fost evaluate utilizând metoda homeostaziei model assessment (HOMA) așa cum a fost descrisă anterior73.,

Evaluările de capacitate de exercițiu și funcția fizică

fitness Cardiorespiratorie a fost determinată de un gradat banda de alergat exercițiu de testare a volitiv epuizare folosind o modificare Balke protocolul anterior described74. Consumul de oxigen (VO2) și RER au fost măsurate folosind spirometrie cu circuit deschis cu un sistem de analiză online, asistat de calculator. Frecvența cardiacă și evaluările efortului perceput (EPR) au fost, de asemenea, măsurate pe parcursul testului.,

rezistenta de Mers pe jos a fost evaluată prin măsurarea distanța parcursă în timpul de 6 min de mers pe jos de sarcină pe un 50-picior (out-și-spate) interior cursul anterior described75.

forta Musculara si rata de cuplul de dezvoltare au fost cuantificată prin măsurarea forța de vârf a produs în timpul contracției voluntare maxime, și rata de cuplul de dezvoltare a fost măsurată folosind viteza maximă de dezvoltare a cuplului în timpul unei rapidă, puternică contracție a genunchiului flexor și extensor muschii cum a fost descris anterior de către noastră laboratory76. Rezistența mânerului a fost măsurată folosind un dinamometru standard.,fatigabilitatea picioarelor a fost evaluată folosind performanța până la eșec în timpul unei sarcini de creștere a călcâiului cu un singur picior. Subiecții au fost rugați să efectueze o completă flexie plantara contracție fiecare 2 s până la eșec, iar testul a fost terminată atunci când subiectul voluntar oprit din cauza disconfort sau incapacitatea de a obține cel puțin 50% de maximă flexie plantara fără ajutorul membrelor superioare pentru mai mult de balance77. Atributul cronic al oboselii a fost, de asemenea, evaluat utilizând un chestionar de oboseală și o scară de severitate a oboselii 78.

echilibrul dinamic a fost evaluat folosind un test de pas rapid., Maximă lungime pas a fost măsurată în fiecare direcție (înainte, înapoi, stânga, dreapta), și obiective au fost plasate pe sol la 80% din subiectul maximă cu linii de bandă colorată, așa cum este descris previously79. Performanța a fost cuantificată ca timpul necesar și numărul de erori comise în medie pe parcursul a trei runde ale testului de echilibru rapid. Fiecare rundă a constat din 18 comenzi care instruiau subiecții să pășească cu un picior aleatoriu într-o direcție aleatorie (adică față stângă)., O eroare a fost definită ca eșecul de a depăși complet ținta, pierderea echilibrului, eșecul de a reveni la poziția inițială de pornire, luarea mai multor pași pentru a atinge complet o țintă sau trecerea cu piciorul incorect sau cu ținta greșită.

Mobilitate a fost evaluată ca timp pentru a finaliza un 4-m de mers pe jos de sarcină (efectuate în duplicat la disciplinele preferate viteza de mers pe jos) și cinci repetate sit-to-stand de testare (realizată în trei exemplare), ca și anterior described75,78,80., Testul presupune ridicarea dintr-o poziție așezată într-un scaun cu înălțime standard de cinci ori, cât mai repede posibil, fără a folosi brațele pentru impuls sau sprijin.

dexteritatea manuală a fost evaluată ca fiind timpul necesar pentru a finaliza un test cu 9 găuri, așa cum s-a descris anterior76. Subiecții au colectat cârlige netede, rotunjite dintr-un vas și le-au așezat într-o placă, apoi le-au întors în farfurie cât mai repede posibil. Două studii au fost finalizate cu fiecare mână.,

analize Statistice

dimensiunea eșantionului pentru acest studiu au fost suficiente pentru a detecta cel puțin o creștere de 50% în NAD+ concentrare următoarele NR suplimentarea vs placebo (mărimea efectului = 0.7; adică de diferența = 7; 1−β = 0.8; α = 0,05), precum și o îmbunătățire clinic relevantă în cardiovasculare parametrul cu cea mai mică mărime a efectului (FMD; diferența de medii = >1%; mărimea efectului = 0.86). Estimarea mărimii efectului pentru NAD+ a fost determinată pe baza datelor preliminare ale concentrațiilor de metabolit NAD+ în Cmpp colectate de la subiecți umani., Dimensiunea efectului pentru FMD a fost determinată de intervențiile încrucișate anterioare ale laboratorului nostru, demonstrând îmbunătățiri ale funcției vasculare67. Dimensiunea necesară a eșantionului a fost determinată a fi 19 subiecți. Presupunând că 20% a abandonului școlar (4 subiecți) și 40% de excludere din cauza ecran eșecuri (în concordanță cu alte studii de intervenție în laboratorul nostru folosind dietetice supplements81,82), un total de 60 de participanți au fost consimțit pentru acest studiu. Semnificația a fost stabilită la α = 0,006 pentru toate rezultatele secundare pentru ajustarea pentru testarea multiplă a NR vs., placebo (teste t asociate) pe fiecare dintre următoarele nouă ipoteze pre-specificate: (1) metaboliți NAD+, (2) parametri cardiovasculari, (3) hematologie, (4) panou metabolic, (5) profiluri lipidice, (6) echilibru energetic, (7) controlul glicemic, (8) funcția motorie și (9) performanța exercițiului. Deoarece multe dintre măsurile din cadrul fiecărei ipoteze sunt corelate între ele (de exemplu, măsuri cardiovasculare, tabelul suplimentar 9), fiecare grup de măsuri enumerate mai sus a fost tratat ca un rezultat atunci când se ajustează pentru comparații multiple., Cu excepția nostru principal rezultatul variabile (NAD+ metaboliți: NAD+, NAAD, ANPH, NaM, NMN), în care concluzii s-au bazat pe o bruta alfa nivelul stabilit la 0,05, toate inferențe de semnificație se bazează pe Bonferroni-a ajustat nivelul alfa (α = 0.006).intenția acestui studiu a fost de a traduce dovezi preclinice promițătoare pentru eficacitatea suplimentării cronice cu compuși de stimulare a NAD+ la om. Prin urmare, fiecare rezultat a fost testat în baza unei ipoteze direcționale care a fost determinată a priori, pe baza studiilor anterioare raportate în literatura de specialitate., În consecință, testele de ipoteză cu o singură coadă au fost utilizate pentru a compara efectele unidirecționale propuse ale suplimentării NR față de placebo asupra acestor rezultate. Această metodă a fost recomandată în altă parte pentru studiile clinice de fază I și ii controlate cu placebo, în care obiectivul este de a obține o perspectivă timpurie asupra eficacității potențiale a unui compus83.înainte de analiză, toate variabilele de rezultat continuu au fost evaluate pentru normalitate utilizând testul Shapiro-Wilk și examinând histogramele de frecvență individuale pentru fiecare rezultat., Dacă o variabilă nu a fost distribuită în mod normal, aceasta a fost transformată în jurnal înainte de analiză. Dacă transformarea jurnalului nu a normalizat datele, starea de tratament a fost analizată folosind testul non-parametric Wilcoxon signed rank. Pentru fiecare variabilă, orice subiect cu o valoare lipsă în timpul fiecărei faze a fost exclus din analiza respectivă. Pe baza interpretării datelor primare, s-au efectuat analize post-hoc pentru a compara modificarea tensiunii arteriale și a rigidității aortice între subiecții care au prezentat valori normale față de valorile normale ale tensiunii arteriale inițiale, utilizând un test T cu două cozi ne-asociat., De asemenea, am explorat relația dintre concentrațiile inițiale de NAD+ și creșterea generală a NAD+ folosind o corelație Pearson. O perioadă formală de eliminare nu a fost inclusă în proiectarea studiului; cu toate acestea, având în vedere designul crossover, am testat prezența unui efect de reportare pentru fiecare dintre rezultatele studiate folosind regresia liniară modelată cu un indicator pentru ordinea tratamentului (nu s-au observat efecte de reportare între condiții). Toate analizele statistice au fost efectuate utilizând platforma de calcul statistic R (versiunea 3.2.2) și software-ul GraphPad Prism 7.

disponibilitatea datelor