Laboratorul de Microbiologie

pata gram, dezvoltată inițial în 1884 de Christian Gram, este probabil cea mai importantă procedură din toată microbiologia. Trebuie să fie una dintre cele mai repetate proceduri făcute în orice laborator. Gram a fost de fapt folosind coloranți pe celulele umane, și a constatat că bacteriile se leagă în mod preferențial unele coloranți. Pata Gram este o pată diferențială, spre deosebire de pata simplă care folosește 1 colorant. Ca urmare a utilizării a 2 coloranți, făcând această procedură o pată diferențială, bacteriile vor deveni violet/albastru sau roz în timpul procedurii.,înainte de colorare, specimenul trebuie montat și fixat pe lamele, așa cum s-a făcut anterior în tehnica simplă de colorare. Datorită celor 2 coloranți utilizați în procedură–cristal violet și safrinin—precum și decolorizatorul acetonă-alcool, bacteriile vor cădea în 2 grupe pe baza reactivității lor gram. Bacteriile Gram pozitive și păstreze cristal violet chiar prin decolorizor pas: bacteriile gram-negative nu reține cristal violet, sunt decolorat, și apoi ridica safrinin colorant., Atât gram + cât și-se leagă de violetul de cristal: pasul cheie pentru diferențierea lor este decolorarea.

aruncați o privire la diagrama însoțitoare a procedurii de pată și efectele acesteia asupra culorii bacteriene. În timpul etapei de cristal violet-iod, moleculele legate în peptidoglicanul peretelui celular gram + și în interiorul membranei sunt ținute strâns. Acetonă-alcoolul determină de fapt moleculele de peptidoglican (aranjate într-o rețea) să se micșoreze, ținând astfel violetiodina de cristal și mai strânsă., În gram-celulă, stratul lipopolizaharidic exterior al peretelui este dizolvat de agenții decoloranți și, deoarece stratul peptidoglican este atât de subțire în acel grup de bacterii, violetul de cristal este levigat din perete.deși există o rutină standard și un set de reactivi utilizați în această pată, fiecare persoană trebuie să găsească o anumită metodă care să funcționeze cel mai bine pentru ei., Numeroasele variabile care pot afecta această pată sunt vârsta culturii, cantitatea de decolorant utilizată, timpul de decolorare, tipul de organism (bacteriile acide și sporii nu pată bine), grosimea frotiului și îngrijirea generală a colorantului.cele mai frecvente motive pentru reacțiile gram false?unele specii bacteriene tind spre variabila gram, și va arăta ambele culori, deși cel mai adesea gram +.

PROCEDURA: face individual

1. Avem culturi de E. coli și Bacillus pentru tine la colorația gram. Acest lucru vă va oferi gram + și gram-controale pentru a verifica procedura împotriva., Puteți utiliza 2 diapozitive, 1 pentru fiecare bacterie sau puteți împărți un diapozitiv în jumătate și puteți froti fiecare bacterie pe diapozitivul divizat. Există, de asemenea, preparate, gram colorate slide-uri de bacterii de diferite forme și dimensiuni de bacterii să se uite la.
2. Faceți frotiul bacterian din bulion, înclinat sau placă.
   • dacă este luat dintr-un bulion, utilizați 1-2 loopfuls din soluția de bulion.
   • dacă este luat dintr-un mediu solid de agar (placă sau înclinare), suspendați inoculul într-o picătură de apă pe diapozitiv și amestecați-l bine.,
   • întindeți suspensia pe diapozitiv astfel încât să acopere o suprafață cel puțin de dimensiunea unui nichel, de preferință un sfert.
   • s-ar putea să vă gândiți să marcați zona de frotiu cu o marcă de creion de ceară din jur, astfel încât să puteți găsi cu ușurință frotiul sub microscop.
   • așezați o bucată de bandă pe partea laterală a frotiului, astfel încât să știți ce cale este în sus.
3. lăsați diapozitivul să se usuce complet la aer înainte de a continua procedura.
4. Heat-fixați diapozitivul ținând diapozitivul la un capăt cu degetele și deplasându-l rapid înainte și înapoi de câteva ori peste flacără.,
5. efectuați procedura de pată așa cum este menționat mai jos.

procedura de colorare

• așezați diapozitivul pe suprapunerea plasei de sârmă pe cada de colorare.
• inundă frotiul cu picături de violet de cristal, lăsând timp de 1 minut. Se spală bine cu apă.
• inundă frotiul cu picături de iod Gram, lăsând timp de 1 minut. Se spală bine cu apă.
• flood acetonă-alcool rapid pe diapozitiv, și se spală în termen de 5-10 secunde (de la începutul decolorizer adăugat). Se spală bine cu apă.
• inundă frotiul cu picături de safrinină, lăsând timp de 1 minut., Se spală bine cu apă.
• șterge uscat cu hârtie bibulous înainte de introducerea pe scena microscop pentru a vizualiza.

1. concentrați-vă pe frotiu folosind lentile cu putere redusă, terminând cu imersia în ulei de 100X. Asigurați-vă că aveți o picătură de ulei pe diapozitiv înainte de a roti obiectivul de 100x în poziție.
2. interpretați rezultatele utilizând protocolul de mai jos.

interpretare

• bacteriile Gram pozitive vor fi albastre/ violet/violet
• bacteriile Gram negative vor fi roz deschis

1. identificați diferitele forme și aranjamente ale bacteriilor.,
2. curățați diapozitivele folosind produsul de curățare pentru diapozitive de la chiuvete.
3. Uită-te la diapozitivele pregătite ale diferitelor bacterii. Veți vedea diferite forme și aranjamente. Întoarceți diapozitivele pregătite pe tăvile de pe bancă.

bacterii Diferite slide-uri