Morfologice și Biologice ale Staphylococcus aureus Biofilm Format în Prezența Plasmei

Introducere

Staphylococcus aureus este o gram-pozitive coc care colonizează mucoasa nazală și a pielii la indivizi sănătoși.1 acest organism poate provoca o gamă largă de boli, de la infecții ale pielii sau ale țesuturilor moi până la boli sistemice și fatale.1-3 în special, s rezistent la meticilină., aureus (MRSA) este un organism periculos datorită rezistenței sale la antibiotice multiple și capacității de formare a biofilmului. Infecțiile cu flux sanguin derivate din dispozitiv sau focal sunt exemple de cazuri severe de boli MRSA. Apariția MRSA dobândită în comunitate (CA-MRSA), pe lângă MRSA convențională dobândită în spital (HA-MRSA), prezintă un risc ridicat pentru pacienții cu imunitate compromisă și persoanele sănătoase.este bine cunoscut faptul că bacteriile care formează biofilm pot supraviețui în prezența unor concentrații mari de agenți antimicrobieni.,4 biofilmele bacteriene constau dintr-o varietate de componente și substanțe atât din bacterii (polizaharidă, peptidoglican și ADN), cât și din gazdă (resturi celulare, produse de coagulare și ADN). Compoziția biofilmului variază în funcție de organismul cauzal și/sau de factorii gazdă.S. aureus posedă un factor de virulență specific numit coagulază, care joacă un rol semnificativ în formarea biofilmului în timpul infecțiilor cu S. aureus., Coagulazei se leagă de gazdă protrombină și forme active staphylothrombin complexe, care convertește solubile monomerice fibrinogenului în auto-polimerizarea insolubil de fibrină și activează cascada coagulării.5 acest fenomen a fost utilizat în laboratoarele de microbiologie clinică ca test de coagulază pentru identificarea speciilor de stafilococ. În ultimii ani, unele rapoarte au sugerat că S. aureus utilizează fibrina și fibrinogenul recrutat de coagulază pentru a forma structura biofilmului.Rapoartele anterioare au demonstrat mecanisme de rezistență la antibiotice în bacteriile care formează biofilm., Chiar și în condiții fără plasmă, bacteriile care formează biofilm prezintă o rezistență ridicată la o varietate de antibiotice. Bariera în calea acumulării și penetrării antibioticelor datorită structurii biofilmului, pe lângă natura tolerantă și statică a bacteriilor din biofilme, sunt cruciale pentru rezistența la antibiotice în organismele care formează biofilmul. Cu toate acestea, cunoștințele despre rezistența comparativă la antibiotice în biofilme cu sau fără plasmă sunt limitate.7,8

în acest studiu, am comparat caracteristicile biofilmului S. aureus format în prezența sau absența plasmei., Analiza a fost efectuată pe două tulpini de referință care au fost reprezentanți ai CA-MRSA și, respectiv, HA-MRSA. Am aplicat microscopie de reflexie confocală cu optimizare continuă (cocrm)9 pentru a observa caracteristicile morfologice ale biofilmului. COCRM ne-a permis să observăm continuu același biofilm fără a adăuga coloranți fluorescenți. În cele din urmă, rezistența la antibiotice a fost comparată în biofilmele S. aureus formate cu condiții fără plasmă și adăugate în plasmă.,

Materiale și Metode

tulpini Bacteriene și de condițiile de cultură

Două tulpini de MRSA, ATCC BAA1556 (FPR3757 tulpina; USA300 clona) și N315 (New York/Japonia clona), au fost utilizate în acest studiu.10,11 Aceste tulpini au fost stocate în Creier, Inima de Perfuzie (BHI) bulion (Becton Dickinson) cu 20% glicerol la -80°C. Înainte de utilizare, tulpinile au fost cultivate peste noapte pe agar BHI și apoi subcultured pentru 12 ore în bulion BHI la 35°C cu agitare la 160 rot / min în condiții aerobe., Un mililitru de cultură a fost centrifugat la 9,000 × g, iar peletele bacteriene au fost suspendate în bulion de soia triptică (Becton Dickinson) conținând 0,25% glucoză (TSBG). Acest pas a fost repetat încă o dată. Concentrațiile minime inhibitorii (Cmi) de vancomicină, linezolid, și rifampicină pentru ambele tulpini au fost de 0,5, 1, și 0,008 µg/mL, respectiv. MICs de daptomicină pentru BAA1556 și N315 au fost 0,5 și 0,25 µg / mL, respectiv. Protocoalele patogenice au fost aprobate de Comitetul de siguranță al Universității Toho pentru agentul patogen (aprobarea nr. 17-55-58).,

Cuantificarea formarea de biofilm în 96-ei bine placa cu cristal violet metoda de colorare

Iepure cu plasmă (Eiken Chimice, Tokyo, Japonia) a fost dizolvat în TSBG și apoi se diluează în continuare cu TSBG. Concentrațiile plasmatice finale au fost ajustate în intervalul 0-12, 5% (v/v). Culturile bacteriene peste noapte au fost diluate până la un OD600 de 0,01 (106-107 CFU / mL) utilizând plasmă care conține TSBG. O sută de alicote microliter au fost apoi inoculate în puțuri individuale ale unei plăci de polistiren cu fund rotund de 96 de puțuri și incubate la 35°C timp de 6-18 ore., După incubare, biofilmele au fost cuantificate după o metodă de colorare cristal violet raportată anterior, cu excepția utilizării a 33,3% acid acetic în loc de etanol.12

Vizualizare de biofilm structura într-o sticlă pe bază de fel de mâncare, folosind COCRM

peste noapte culturi au fost diluat la o OD600 de 0,01 folosind TSBG sau TSBG conțin 7.14% cu plasmă. Alicoturile de doi mililitri au fost inoculate în vase pe bază de sticlă (Iwaki, Tokyo, Japonia) și incubate la 35°C timp de 12 sau 24 de ore., După incubare, biofilmele formate pe suprafața sticlei au fost spălate cu apă, iar structurile biofilmului au fost vizualizate de COCRM folosind un microscop de scanare laser Carl Zeiss (LSM 710) echipat cu un plan de apertură numerică 63 × /1.40-obiectiv apocromatic.Biofilmele 9,13 și suprafețele de sticlă au fost iluminate cu laser cu argon de 514 nm, iar lumina reflectată a fost colectată printr-un filtru de bandă de trecere de 505-530 nm. Ca splitter de fascicul, a fost utilizată o jumătate de oglindă NT 80/20. Imaginile COCRM au fost analizate cu Carl Zeiss software (ZEN 2011).,celulele de flux (IBI Scientific, Dubuque, IA) au fost irigate continuu cu mediu proaspăt (TSBG sau TSBG conținând 0,39% plasmă) folosind o pompă peristaltică (Ismatec, Glattbrugg, Elveția).14 culturile bacteriene peste noapte au fost diluate la un OD600 de 0.01 folosind TSBG. Patru sute de microlitru alicote au fost apoi injectate la fiecare dintre cele trei robinete conectat la capetele distale ale fluxului de celule și de cultură timp de 1 oră la 35°C pe suprafața de sticlă de celule de debit fără debit., După confirmarea aderenței inițiale utilizând COCRM, fiecare mediu curgea la o viteză de 0,2 mL/min. Biofilmele au fost incubate timp de 24 de ore la 35°C. formarea biofilmului a fost evaluată de COCRM la fiecare 3 ore.efectele modificărilor medii asupra formării biofilmului într-un vas pe bază de sticlă

am stabilit un protocol similar modelului flow cell folosind vase de sticlă pentru a analiza activitatea antimicrobiană împotriva biofilmului plasmatic, deoarece vasul de sticlă este foarte versatil pentru a observa formarea biofilmului plasmatic. Culturile peste noapte au fost diluate la un OD600 de 0,01 în TSBG sau TSBG conținând 0.,78% plasmă. Alicoturile de doi mililitri au fost inoculate în vase pe bază de sticlă și incubate static la 35°C în condiții aerobe timp de 1 oră pentru a permite aderența inițială. Acest pas face posibilă observarea aderenței bacteriilor la suprafața sticlei prin microscopie de reflexie confocală (CRM). Ulterior, mediile de cultură au fost reîmprospătate în fiecare oră pentru a menține o aprovizionare constantă cu plasmă timp de 6 ore în total. Mediul cu plasmă a fost înlocuit de cinci ori în decurs de 6 ore (la 1, 2, 3, 4 și 5 ore)., După incubare, biofilmele formate pe suprafața sticlei au fost spălate cu apă, iar structurile biofilmului au fost vizualizate de COCRM.

Vizualizare de antibiotic pătrunderea și acumularea în interiorul biofilmului folosind fluorescent-etichetate vancomicină și daptomicină

peste Noapte culturi au fost diluat la o OD600 de 0,01 în TSBG sau TSBG conțin 0.78% cu plasmă. Alicoturile de doi mililitri au fost inoculate în vase pe bază de sticlă și incubate la 35°C. În timpul incubării de 6 ore, mediile de cultură au fost reîmprospătate în fiecare oră., După îndepărtarea plutitoare bacterii de spălat de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), fluorescent-etichetate antibiotice (BODIPY-FL-vancomicină sau BODIPY-FL-daptomicina) au fost adăugate la sticlă, pe bază de preparate. BODIPY-FL-vancomicina a fost achiziționat de la Invitrogen, în timp ce BODIPY-FL-daptomicină a fost sintetizat din BODIPY-FL NHS Ester (Invitrogen) și daptomicină de Toho Universitatea de Științe Farmaceutice. Ambele antibiotice au fost dizolvate în dimetil sulfoxid și apoi diluate cu PBS având concentrația de ioni de calciu ajustată la 50 mg / L., Concentrația finală a BODIPY-FL-vancomicinei adăugată la biofilme a fost de 2 µg/mL. BODIPY-FL-daptomicina sintetizată a prezentat o intensitate slabă a fluorescenței în comparație cu vancomicina și, prin urmare, concentrația finală a fost ajustată la 20 µg/mL. Permeabilitatea ambelor antibiotice în structurile biofilmului a fost monitorizată timp de 60 de minute cu ajutorul unui microscop de scanare laser Carl Zeiss (lsm 710). Biofilmele au fost iluminate cu laser de argon de 488 nm, iar lumina reflectată a fost detectată la un câștig de 550., De asemenea, coloranții BODIPY-FL au fost iluminați cu laser cu argon de 488 nm, iar fluorescența verde a fost detectată pentru vancomicină și daptomicină la un câștig de 670 și respectiv 600. Imaginile seriale au fost analizate cu un software Carl Zeiss (ZEN 2011).

determinarea Cantitativă de bacterii viabile număr după expunerea la antibiotice

peste noapte culturi au fost diluat la o OD600 de 0,01 folosind TSBG sau TSBG conțin 0.78% cu plasmă. Alicote de doi mililitri au fost inoculate în plăci de polistiren cu șase puțuri și incubate la 35°C., În timpul incubării a 6 ore, mediul de cultură a fost reîmprospătat în fiecare oră. După îndepărtarea plutitoare bacterii, biofilme au fost spălate de două ori cu TSBG, și apoi tratate cu 64 × MICROFON de antibiotice timp de 12 ore la 35°C. Aceste antibiotice au fost dizolvate în TSBG cu concentrația de calciu ajustat la 50 mg/L. Numai rifampicină a fost dizolvat în metanol și apoi se diluează cu TSBG conțin 50 mg/L Ca2+. Concentrația finală de metanol a fost de 500 µL/mL. În acest experiment, TSBG conținând 50 mg / l Ca2+ și metanol au fost utilizate ca control al bulionului., Bacteriile plutitoare au fost îndepărtate după tratament, iar biofilmele au fost spălate de două ori cu soluție salină. Două mililitri de proteinază K (0,1 mg/mL; WAKO, Osaka, Japonia) dizolvate în PBS au fost utilizate pentru a slăbi structurile biofilmului. Biofilmele tratate cu proteinază K au fost decojite cu un răzuitor.15 suspensiile de biofilm au fost plasate ușor la 37°C timp de 30 de minute și apoi diluate cu soluție salină și placate pe agar nutritiv pentru a număra numărul de bacterii încorporate în biofilm. După creșterea la 35°C, coloniile au fost numărate.

testul viabilității bacteriene vii / moarte

colorarea viabilității S., aureus biofilm cu sau fără plasmă după tratamente cu diferiți agenți anti-MRSA a fost efectuat. Culturile peste noapte au fost diluate până la un OD600 de 0,01 în TSBG sau TSBG conținând 0,78% plasmă. Apoi, 200 µL alicote au fost inoculate în camera de acoperire cu opt puțuri (IWAKI) și incubate la 35°C. mediile au fost reîmprospătate la fiecare oră timp de 6 ore. După îndepărtarea plutitoare bacterii, biofilme au fost spălate de două ori cu TSBG, și apoi tratate cu 64 × MICROFON de antibiotice timp de 12 ore la 35°C. Aceste antibiotice au fost dizolvate în TSBG cu Ca2+ concentrare ajustat la 50 mg/L., Rifampicina a fost dizolvată în metanol și apoi diluată cu TSBG conținând 50 mg/L. concentrația finală de metanol a fost de 500 µL/mL. În acest experiment, TSBG conținând 50 mg / l Ca2+ și metanol au fost utilizate ca control al bulionului. Bacteriile plutitoare au fost îndepărtate după tratament. Viabilitatea bacteriană a biofilmului a fost determinată de setul de viabilitate a biofilmului FilmTracer™ LIVE/DEAD® (Molecular sonde). Celulele viabile au fost colorate cu SYTO 9 (verde), în timp ce bacteriile moarte au fost colorate cu iodură de propidiu (roșu)., După tratament, bacteriile suspendate au fost îndepărtate și colorate cu soluție de colorare vie/moartă timp de 20 de minute. După colorare, supernatantul a fost îndepărtat și spălat de două ori cu apă pură, iar apoi activitatea bactericidă a agentului antibacterian a fost evaluată vizual prin microscopul confocal cu scanare laser.

analiză statistică

rezultatele analizate folosind prisma GraphPad 5.0 sunt prezentate ca valoare medie ± deviație standard. Rezultatele au fost considerate semnificative statistic când valoarea p a fost <0, 05., Rezultatele experimentelor cantitative efectuate în Fig. 1 și 6 au fost analizate prin analiza varianței (ANOVA) cu un test de Tukey.

Rezultate

Efecte de plasmă pe S. aureus formarea de biofilm

Am examinat formarea de biofilm în diferite concentrații plasmatice pentru două tulpini de S., aureus, BAA1556 și N315. La ambele tulpini, prezența plasmei chiar și la concentrații scăzute (0,09%) a indus o creștere a formării biofilmului după 6 ore de incubare (Fig. 1). În tulpina BAA1556, creșterea dependentă de concentrație a formării biofilmului a fost observată de la 3,12% plasmă, iar creșterea substanțială a fost observată la 12 și 18 ore. În tulpina N315, s-a observat o creștere de peste trei ori a formării biofilmului de la 6 la 12 ore în absența plasmei, fără nicio diferență între 0% și 0,09% plasmă la 12 ore., Dimpotrivă, o tendință de reducere treptată dependentă de concentrație a masei biofilmului a fost observată în tulpina N315, de la 0,78% sau mai mare concentrație de plasmă.

caracteristicile morfologice ale biofilmului S. aureus în prezența plasmei

biofilmul S. aureus s-a format la incubarea statică în prezența sau absența plasmei, iar microstructura biofilmului a fost comparată de COCRM. Așa cum se arată în Fig. 2, un biofilm uniform și plat a fost format în absența plasmei în ambele tulpini BAA1556 și N315., În contrast, biofilmul neuniform și structurat agregat a fost observat în prezența plasmei în ambele tulpini. Morfologia microscopică a biofilmului S. aureus format în prezența plasmei a fost distinct diferită de cele formate fără plasmă și, prin urmare, acestea sunt denumite în continuare biofilm plasmatic.

S. aureus formarea de biofilm în fluxul de celule starea în prezența plasmei

de curgere-sistem de celule, care reprezintă un punct de vedere clinic relevante stare, a fost folosit pentru a observa efectul continuă cu plasmă aprovizionare pe formarea de biofilm., Am comparat punctele timpurii de timp ale formării biofilmului în celula de flux în prezența sau absența plasmei de către COCRM (Fig. 3). Fără plasmă, atașarea câtorva bacterii a fost observată după 3 ore de incubație. În schimb, agregatele de formare a biofilmului au fost observate în prezența plasmei în ambele tulpini de S. aureus. Structura acestui biofilm plasmatic după 3 ore în sistemul de celule de flux a fost similară cu biofilmul plasmatic în stare statică la 12 ore (Fig. 2)., Cu toate acestea, în starea celulei de flux, detașarea biofilmului plasmatic agregat a fost observată la punctele de incubare ulterioare (datele nu sunt prezentate).

Pătrunderea și acumularea de vancomicină în S. aureus biofilm

BAA1556 și N315 tulpini au fost incubate în TSBG mediu, în prezența sau absența 0.78% cu plasmă. Mediul de cultură a fost reîmprospătat în fiecare oră timp de 6 ore. În starea de control, structura biofilmului cu sau fără plasmă a fost examinată de COCRM (Fig. 4-i). Apoi, în cultură s-a adăugat vancomicină marcată cu fluorescență verde, iar biofilmul a fost observat timp de încă 1 oră., Penetrarea și acumularea de vancomicină au fost comparate în prezența sau absența plasmei prin microscopie confocală cu scanare laser. Așa cum era de așteptat, s-au observat diferențe izbitoare în structurile biofilmului între probele cu sau fără plasmă. Adăugarea de vancomicină fluorescentă verde a subliniat în continuare diferențele dintre biofilmele cu sau fără plasmă. În biofilmul fără plasmă, distribuția difuză a fluorescenței verzi a fost observată la ambele tulpini., În schimb, structurile brute de pe suprafață, colorate neregulat cu fluorescență verde, au fost observate în biofilmul crescut în prezența plasmei (Fig. 4-ii). În biofilmul S. aureus în stare fără plasmă, difuzia și fluorescența verde puternică au fost observate la 5 minute după administrarea de vancomicină, care s-a intensificat ulterior. În schimb, biofilmul plasmatic a prezentat caracteristici diferite de colorare în ambele tulpini de S. aureus., Fluorescența verde a fost observată slab în biofilmul plasmatic la 5 minute, iar ulterior acumularea de fluorescență verde a crescut treptat. Aceste date demonstrează o întârziere în penetrarea și acumularea vancomicinei în biofilmul plasmatic, comparativ cu biofilmul fără plasmă (Fig. 4-iii).

de Evaluare a acumulării de daptomicină în S. aureus biofilm de-a lungul timpului

Am folosit verde fluorescenta-etichetate daptomicină și examinate pătrunderea și acumularea de daptomicină în S. aureus biofilme. Deoarece intensitatea fluorescenței daptomicinei a fost mai slabă decât cea a vancomicinei, în experiment a fost utilizată o concentrație mai mare de daptomicină., În biofilmul format în absența plasmei, fluorescența verde a fost vizibilă de la 10 la 20 de minute, după care intensitatea fluorescenței a crescut într-o manieră dependentă de timp pentru ambele tulpini de S. aureus. În schimb, fluorescența verde a fost greu detectabilă în biofilmul plasmatic, chiar și după 60 de minute de incubare (Fig. 5). Aceste date sugerează că a întârziat penetrarea și acumularea daptomicinei în biofilmul plasmatic, comparativ cu biofilmul fără plasmă., Din păcate, nu am putut compara datele dintre vancomicină și daptomicină, din cauza diferențelor în intensitățile fluorescente verzi ale antibioticelor.

Efectul antibioticelor asupra bacteriilor suma în biofilm format cu sau fără plasma

Am comparat activitatea bactericidă a antibioticelor asupra biofilmelor formate cu sau fara plasmă. Înainte de tratament, un număr similar de celule bacteriene a fost recuperat din biofilme fără plasmă și fără plasmă., Acest rezultat sugerează că cantitatea de formare a BF a crescut proporțional cu gradul de acumulare a componentelor extracelulare, inclusiv proteina factorului de coagulare, dar independent de numărul de celule bacteriene aderente. Antibioticele anti-MRSA vancomicină, daptomicină sau linezolid, cu rifampicină, au redus numărul de bacterii în biofilmul fără plasmă. Cu toate acestea, biofilmele plasmatice ale ambelor tulpini de S. aureus au fost, în general, mai rezistente la antibiotice, chiar și în combinație cu rifampicina., Pentru BAA1556 tulpina, stare indusă mai mult de două log reducere bacteriană număr, întrucât N315 tulpina a arătat o reducere semnificativă bacteriene număr în plasmă biofilm în prezența rifampicina, vancomicina cu rifampicină și daptomicină cu rifampicină (Fig. 6). Aceste rezultate sugerează că biofilmele plasmatice sunt mai rezistente la activitatea bactericidă a antibioticelor anti-MRSA examinate. De asemenea, am efectuat colorarea viabilității pentru a diferenția celulele vii și moarte în probele de mai sus., Unele rezultate de colorare au fost în concordanță cu numărul bacterian, dar au existat mai multe discrepanțe între colorare și numărul de bacterii (Fig suplimentar. S1).metoda COCRM a fost, pentru prima dată, aplicată pentru observarea biofilmului S. aureus, care a arătat creșterea rapidă a biofilmelor în prezența plasmei. Penetrarea sau acumularea întârziată a antibioticelor și rezistența la activitatea bactericidă a agenților anti-MRSA au fost, de asemenea, observate în biofilmele plasmatice., Aceste rezultate sugerează că biofilmul plasmatic este substanțial diferit morfologic și biologic de biofilmul fără plasmă.

așa cum se arată în Fig. 1, prezența formării biofilmului plasmatic îmbunătățit la 6 ore în ambele tulpini de S. aureus, chiar și la o concentrație de 0,09% plasmă. La momente ulterioare, formarea biofilmului a fost îmbunătățită pentru tulpina BAA1556 în prezența a 3,12% sau mai mult plasmă, dar nu tulpina N315. În schimb, s-a observat o tendință de reducere a masei biofilmului pentru tulpina N315 în concentrații plasmatice mai mari., Deoarece metoda de colorare cristal violet evaluează atașarea biofilmului la puțurile de microplăci, este probabil ca detașarea biofilmului și formarea noului biofilm să reflecte masa totală a biofilmului. Prin urmare, am observat dispersia sau detașarea biofilmului în sistemul de celule flux și prin incubare statică, în special la concentrații mai mari de plasmă la punctele de incubare ulterioare (datele nu sunt prezentate).,

în sistemul de celule de flux observat de COCRM, biofilmul agregat a fost observat în decurs de 3 ore de la incubare, ceea ce a fost similar cu 12 ore de incubare a biofilmului plasmatic în stare statică. O aprovizionare continuă cu plasmă imită probabil mai îndeaproape mediul in vivo, ceea ce ar putea accelera formarea biofilmului în sistemul de celule de flux. COCRM este o tehnică nou dezvoltată,13 care ne-a permis să observăm cursul temporal al maturării și detașării biofilmelor fără a utiliza coloranți fluorescenți., Prin urmare, COCRM ar putea fi folosit ca un instrument puternic pentru a analiza mecanismul de formare a biofilmului și pentru a evalua strategiile terapeutice potențiale în cercetarea biofilmului.am observat diferențe semnificative între acumularea de vancomicină și daptomicină între biofilmul plasmatic și cel fără plasmă. Jefferson și colab. a raportat că, în timp ce vancomicina se leagă de bacteriile plutitoare libere în apă în 5 minute, a durat mai mult de 1 oră pentru a lega celulele în straturile cele mai adânci ale unui biofilm fără plasmă.,16 în experimentele cu biofilm fără plasmă, la concentrații terapeutice de vancomicină, matricea biofilmului nu a reprezentat un obstacol în calea difuziei vancomicinei.17 cu toate Acestea, atunci când plasmă umană-acoperite wells au fost folosite, de droguri a crescut sensibilitatea a fost observată tranzitor în faza precoce (≤24 ore), întrucât în vârstă, dens biofilme au prezentat un nivel ridicat de rezistenta la momente ulterioare (>48 de ore).6 Cardile și colab. a demonstrat că expunerea S., aureus la plasmă a dus la o creștere semnificativă a componentelor microbiene de suprafață, iar biofilmele augmentate cu plasmă au prezentat o toleranță crescută la vancomicină în comparație cu biofilmul crescut în medii fără plasmă.7 mai mult, în modelul de șoarece al infecțiilor cu grefă vasculară protetică, daptomicina a fost ineficientă în eradicarea biofilmelor, deoarece matricea a acționat ca un scut pentru difuzia antibioticelor.18 aceste rezultate sugerează că S., rezistența sau toleranța aureus legate de biofilm la agenții anti-MRSA ar putea fi legate de mai mulți factori, cum ar fi prezența plasmei, timpul de incubare, modificarea structurii suprafeței bacteriene și diferențele de tulpină.am observat o activitate bactericidă redusă cu antibioticele anti-MRSA în biofilmul plasmatic, comparativ cu biofilmul fără plasmă în ambele tulpini. Deși cantitatea de formare a biofilmului a crescut în prezența plasmei, numărul de bacterii nu a crescut., Se crede că creșterea formării biofilmului obținută folosind componente plasmatice interferează cu activitatea agentului antimicrobian. În tulpina N315, adăugarea de rifampicină a crescut activitatea bactericidă a vancomicinei și daptomicinei, dar efectul său a fost slab cu tulpina BAA1556. Deși studiul a examinat două tulpini diferite, CA-MRSA (BAA1556) și HA-MRSA (N315), este necesar să se examineze mai multe tulpini pentru o mai bună înțelegere a tulpina diferențe și mecanismele de rezistență și pentru a identifica terapeutice eficiente combinații de plasmă biofilm.,în acest studiu, am folosit plasma de iepure pentru a analiza biofilmul plasmatic. Cu toate acestea, plasma umană trebuie utilizată pentru a clarifica comportamentul real al biofilmului plasmatic în corpul uman. Mai mult, plasma a fost utilizată în concentrație scăzută (0,39-7,14%), deoarece concentrația plasmatică ridicată determină coagularea mediului prin coagulază din MRSA, ceea ce împiedică evaluarea biofilmului plasmatic. Cu toate acestea, o creștere semnificativă a cantității de formare a biofilmului a fost confirmată în aceste condiții de proteină redusă a factorului de coagulare, comparativ cu sângele., Un sistem de coagulare ar putea fi activat in vivo și, prin urmare, sunt necesare studii suplimentare pentru a investiga Condițiile mai apropiate de corpul uman în viitor.în concluzie, am raportat efectele plasmei asupra formării biofilmului de CA-MRSA și HA-MRSA. Datele arată că plasma este un factor crucial în determinarea nu numai a masei biofilmului în sine, ci și a naturii biologice a biofilmului, inclusiv a sensibilității la penetrarea sau acumularea de antibiotice și a rezistenței la medicamente anti-MRSA., Aceste rezultate subliniază și mai mult importanța biofilmelor plasmatice în înțelegerea obstacolelor asociate cu eradicarea și tratamentul în mediul noptierelor. Biofilmele plasmatice formate în modelul flow-cell ar putea reprezenta o condiție experimentală relevantă clinic, iar aplicarea COCRM facilitează analiza ulterioară a mecanismelor de formare a biofilmului și permite screening-ul pentru strategii noi de combatere a infecțiilor cu MRSA.

declarație de divulgare

nu există interese financiare concurente.

material suplimentar

figura suplimentară S1