un estudio comparativo sobre los diferentes métodos de tinción y número de muestras para la detección de bacilos rápidos ácidos

Vol. 95 (6): 855-858, Nov./ Dec., 2000

Mustafa Ulukanligil+, Gonul Aslan, Sami Tasçi

Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina de la Universidad de Harran, Sanliurfa, Turquía

la presencia de bacilos rápidos ácidos en múltiples muestras se investigó comparativamente con la tinción de Ziehl-Neelsen (ZN) y microscopía de fluorescencia (FM) para determinar la sensibilidad en la detección de tuberculosis (TB). Un total de 465 muestras obtenidas de 295 pacientes fueron analizadas en el Hospital de la Facultad de Medicina de la Universidad de Harran entre marzo de 1998 y marzo de 2000. Se utilizó la cultura como método de referencia. Sesenta y ocho pacientes (23.,1%) fueron diagnosticados de TB por cultivo. Las sensibilidades de tinción ZN y FM fueron del 67,6% (46/68) y 85,2% (58/68) respectivamente. Doscientos un pacientes (68,1%) presentaron una muestra al laboratorio. Se detectó TB positiva en 42 (20,9%) de estos pacientes por cultivo. Las sensibilidades de las tinciones de Zn y FM fueron del 61% y del 83% en estos pacientes. Sin embargo, en 18 pacientes (6,1%) que presentaron dos muestras al laboratorio, la TB fue positiva en seis de ellos (33,3%) y las sensibilidades ZN y FM fueron 66% y 83% respectivamente., Cuando se recogieron tres muestras o más de los pacientes (76 pacientes, 25,8%), se determinó la positividad a la TB en 20 de ellos (26,3%) y las sensibilidades fueron del 80% y 92% en los frotis teñidos con ZN y FM, respectivamente.

nuestros datos indican que en el diagnóstico de TB, La FM tiene mayor sensibilidad que la ZN. En particular, en el caso de una sola muestra, el valor diagnóstico de FM es bastante significativo. Por lo tanto, es posible concluir que tanto la tinción ZN como la FM pueden usarse para el diagnóstico de TB cuando hay más de dos muestras., Sin embargo, si solo se dispone de una o dos muestras, es preferible la tinción FM.

Palabras Clave: Mycobacterium tuberculosis – sensitivity-Ziehl Neelsen-fluorescence microscopy

la Tuberculosis (TB) sigue siendo un problema de salud importante, con una estimación de 8 millones de nuevos casos y 3 millones de muertes por esta enfermedad cada año en todo el mundo (Dixie et al.1993). Cada año se notifican entre trescientos y cuatrocientos casos nuevos en Sanliurfa (Turquía) de una población de 400.000 personas (informe estadístico del dispensario de tuberculosis de S. urfa, 1998)., Varios factores son responsables del brote de TB en la región: el deterioro de las condiciones socioeconómicas, con bajos ingresos y educación inadecuada, y el gran desconocimiento de la enfermedad, como lo demuestra el hecho de que los pacientes a menudo dejan de tomar medicamentos cuando sus síntomas han desaparecido. Aunque el virus de inmunodeficiencia humana es el principal factor en los brotes de tuberculosis en lugares como los Estados Unidos y África, es bastante raro en el sur de Turquía.

la mayoría de los libros de texto estándar de laboratorio (Janda 1997, Sommers et al., 1988) y guidelines for mycobacteriology laboratories (Kent & Kubica 1985) sugieren que al menos tres especímenes, preferiblemente recolectados en tres días consecutivos, deben ser enviados al laboratorio para frotis y cultivo de bacilos ácido-rápidos (AFB) por pacientes sospechosos de tener tuberculosis. La detección de AFB en frotis directos preparados con esputa concentrada, orina y muestras de otros fluidos corporales tiene un valor clínico y epidemiológico considerable y sigue siendo la prueba de diagnóstico rápido más utilizada para la tuberculosis en la mayoría de los países en desarrollo (Nelson et al. 1998)., Si bien se han desarrollado nuevas técnicas de diagnóstico radiométrico y molecular que se utilizan ampliamente en el mundo desarrollado (Heifets 1997), se estima que entre el 60% y el 70% de todos los casos de TB se diagnostican mediante frotis de esputo (Guthie et al. 1993). Dos métodos tradicionales de tinción, a saber, la microscopía de fluorescencia (FM) y el método Ziehl-Neelsen (ZN) están fácilmente disponibles (Nagpaul 1967). El método ZN se ha utilizado comúnmente en todo el mundo, particularmente en los países en desarrollo, debido a su simplicidad y bajo costo (Guthie et al. 1993)., Varios informes (Lempert 1944, Boyd & Marr 1975, Janda 1997) han indicado que FM tiene una mayor sensibilidad y ahorra tiempo en comparación con el método ZN. Una desventaja de la técnica FM es que a veces puede producir resultados falsos positivos. Sin embargo, la mayoría de estos pueden prevenirse volviendo a colocar el frotis de acuerdo con el método ZN para microscopía de luz brillante (Holst et al. 1959, Heifets 1997).,

en el presente estudio, estas dos técnicas fueron comparadas en términos de sensibilidad en el diagnóstico de TB, y se examinó la correlación entre sensibilidad y el número de muestras recolectadas. Además, a la luz de nuestros resultados y la literatura disponible, tratamos de identificar aquellas técnicas adecuadas a nuestras circunstancias.,

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

doscientos noventa y cinco paciente con sospecha de TB fueron remitidos a nuestra clínica (Clínico, Laboratorio de Microbiología, Harran de la Universidad de la Escuela de medicina del Hospital) y un total de 460 muestras fueron recolectadas de ellos entre Marzo de 1998 y Marzo de 2000., Estas muestras consistieron en 430 muestras de esputo, 17 de orina, 4 de lavado gástrico y 3 de absceso cervical, 3 de fluidos pleurales, 1 de líquido peritoneal, 1 de biopsia de ganglio linfático cervical y 1 de semen.

todas las muestras de esputo fueron descontaminadas y concentradas utilizando el procedimiento de N acetil-L-cisteína-hidróxido de sodio recomendado por el Centro de control y prevención de enfermedades (Kent & Kubica 1985)., El esputo, la orina y otras muestras se prepararon utilizando el método convencional de centrifugación y los frotis se teñieron con tinciones de carbolfuchsina (ZN) y Auramin-O (fluorocromo) (Ebersole 1995). El esputo, la orina y otros sedimentos de especímenes se inocularon en medios Lowenstein-Jensen y se incubaron a 37oC en 5% de CO2 durante un máximo de seis semanas (Lambi 1995). El cultivo fue utilizado como método de referencia y comparado con las técnicas ZN y FM., Para registrar los números de AFB determinados en los frotis teñidos bajo microscopía de inmersión (aumento x1000), se utilizó la siguiente escala de reporte: más de 9 AFB por campo (4+), 1-9 AFB por campo (3+), 1-9 AFB por 10 campos (2+), 1-9 AFB por 100 campos (1+). Cuando solo se detectaron unos pocos AFB en 300 campos, los resultados se consideraron cuestionables. Para equiparar el número de bacilos observados con FM (aumento de 400x) con el número de bacilos observados con microscopía de inmersión (aumento de 1000x), los valores se dividieron por 4 (American Thoracic Society 1981).,

resultados

doscientos un pacientes (68.1%) presentaron una muestra para el examen de AFB y en 42 (20.9%), el organismo se aisló de esputo (40 casos), material de absceso (1 caso) y material de biopsia de ganglio linfático (1 case). En estos 42 pacientes, 28 muestras de esputo arrojaron resultados positivos con tinción ZN y 38 (37 esputo, 1 absceso cervical) arrojaron resultados positivos con tinción FM. Las sensibilidades de la tinción ZN y FM fueron del 61% y 83% respectivamente (p< 0,05) (Tabla II).,

observamos que los frotis positivos con ZN y FM contenían entre 1 y 9 AFB por campo. Los 14 frotis positivos, que no se detectaron con frotis teñidos con ZN, Se detectaron bacilos de baja densidad (1-2 bacilos por 100 campos) en frotis teñidos con FM. Solo se observó un resultado falso positivo con el método FM, por lo tanto, las especificidades de la tinción ZN y FM fueron encontradas como 100% y 99% respectivamente.

dieciocho (6.1%) pacientes presentaron dos muestras al laboratorio y en el 33.3% (6 de 18) de estos pacientes, el organismo se recuperó en 1 o 2 de las muestras de esputo., Cuatro de ellos produjeron resultados positivos con la tinción ZN (sensibilidad, 66%) y 5 produjeron resultados positivos con la tinción FM (Sensibilidad, 83%). No se detectaron dos pacientes positivos sobre la base de frotis teñidos con ZN. Los frotis de un paciente, que fueron teñidos con MF, contenían 3-5 bacilos en cada 30-40 campos, mientras que los frotis del otro paciente fueron negativos tanto con FM como con ZN. No se detectaron resultados falsos positivos en estos pacientes.

tres o más muestras fueron presentadas por el 25,8% de los pacientes (76 de 153) y 20 de estos pacientes (26.,3%) se diagnosticó TB aislando el organismo en una o más muestras de esputo. Dieciséis de ellos produjeron resultados positivos con la tinción ZN (sensibilidad, 80%) y 18 produjeron resultados positivos con la tinción FM (Sensibilidad, 92%). No se detectaron resultados falsos positivos en estos pacientes (Tabla II).

se recolectaron diecisiete muestras de orina para AFB, pero ninguna de ellas resultó positiva en frotis o cultivos teñidos., Asimismo, otras muestras (3 líquido pleural, 4 lavado gástrico, 1 líquido peritoneal, 2 abscesos cervicales y 1 semen) resultaron negativas con tinción y cultivo de ZN y FM, a excepción de una muestra de absceso cervical que dio resultado positivo con tinción y cultivo de FM. Una muestra de ganglio linfático cervical produjo M. tuberculosis solo en cultivo.

discusión

Turquía es un país en desarrollo y la TB sigue siendo una enfermedad común, particularmente en el sureste del condado., En Sanliurfa, una ciudad en el sureste, las condiciones económicas siguen siendo muy malas y cada año se registran entre 300 y 400 nuevos pacientes de tuberculosis.

en los últimos años, se han desarrollado varias técnicas radiométricas y moleculares para el diagnóstico de la TB. Las técnicas radiométricas reducen el tiempo de rotación de AFB. Sin embargo, no son adecuados para esta región de Turquía debido a su alto costo (Heifets 1997). Hay poco margen incluso para el uso de técnicas moleculares debido a nuestros limitados recursos financieros. Los métodos convencionales como ZN y FM son técnicas rápidas y simples con un costo bastante bajo., Hasta ahora solo se ha utilizado ZN para el diagnóstico de TB en esta región. Sin embargo, tiene un bajo nivel de sensibilidad en comparación con el método FM. El presente estudio fue nuestro primer intento de utilizar la FM y compararla con la ZN.

se realizó en un estudio comparativo la confiabilidad de los métodos FM y ZN en el examen de frotis para AFB. Se encontró que las especificidades de FM y ZN fueron 99% y 100%, y las sensibilidades con una muestra fueron 83% y 61%, respectivamente. Cuando se aumentó el número de muestras, aumentó la sensibilidad de ambos tipos de tinción., Cuando se utilizaron más de dos especímenes, se encontró que las sensibilidades eran similares. Por lo tanto, es posible decir que si tenemos menos de tres muestras, la confiabilidad de FM es mucho mayor que la de ZN. A menos que se presentara más de una muestra, lo que no era fácil en las condiciones socioeconómicas y culturales existentes, La FM resultó ser más confiable que el método ZN. Además, otra ventaja de la FM era que permitía la detección de frotis positivos, que se pasaban por alto con frotis teñidos con ZN que contenían bacilos de baja densidad., El uso de FM aumenta significativamente el valor diagnóstico del frotis, particularmente cuando hay bacilos de baja densidad que pueden escapar a la detección en frotis teñidos con ZN. Nuestros resultados coincidieron con los de Guthie et al. (1993), Ba y Rieder (1999), y Pollack y Wieman (1977), quienes informaron que la FM parece ser más propensa a detectar TB en frotis que contienen bacilos de baja densidad.

muchos informes (Sommers et al. 1988, Nelson et al., 1998) han demostrado que las micobacterias pueden liberarse irregularmente de los pulmones, y que incluso es posible encontrar resultados positivos y negativos en el mismo paciente durante el mismo período. Por lo tanto, se aconseja que se recoja más de una muestra de pacientes sospechosos de tener TB. Algunos otros informes (Ozturkeri et al. 1997, Durupinar et al. 1997, Pollock & Wieman 1997) han afirmado que las reacciones positivas falsas podrían ocurrir con FM. Solo se observó un resultado falso positivo en el presente estudio., Además, no se produjeron reacciones positivas falsas en nuestra investigación con el método ZN.

Nuestra prioridad en este estudio fue encontrar un método rápido y rentable para el diagnóstico de TB en Sanliurfa. Concluimos que el método FM es bastante económico en términos de tiempo y gasto y se recomienda para laboratorios que manejan un gran número de muestras de esputo. Descubrimos que FM es más confiable que ZN. Sin embargo, todo el personal que debe examinar muestras de esputo debe familiarizarse con la FM para evitar resultados falsos positivos y/o negativos., Por lo tanto, se sugiere que hasta que no haya personal calificado para la investigación de la AFB, los frotis se tiñan con ambas manchas y luego se examinan comparativamente. Después de que el personal del laboratorio se familiarice con el método FM, este método se puede usar rutinariamente por sí solo.

  • de la American Thoracic Society 1981. Normas diagnósticas y clasificación de la tuberculosis y otras enfermedades mi-cobacterianas. Am Rev Respir Dis 123: 343-358.
  • Ba F, Rieder HL 1999., Una comparación de la microscopía de fluorescencia con la técnica de Ziehl-Neelsen en el examen de esputo para bacilos rápidos ácidos. Int J Tuberc Lung Dis 3: 1101-1105.
  • Boyd JR, Marr JJ 1975. Disminución de la fiabilidad de las técnicas de frotis rápido ácido de detección de tuberculosis. Ann Intern Med 82: 487.
  • Dixie e, Snider JR, Dooley WS 1993. Tuberculosis Nozocomial en la era del SIDA con énfasis en la enfermedad multirresistente. Heart and Lung 22: 365-369.
  • Durupýnar B, Birinci a, Gunaydýn M, Sanic a 1997., La fiabilidad de la técnica de tinción auramina-rodamina en el diagnóstico de tuberculosis. Bull Microbiol 31: 369-374.
  • Ebersole LL 1995. Procedimientos de tinción Acid-fast en micobacteriología. En HD Isenberg, Clinical Microbiology Procedures Handbook, Amer Soc Mi-crobiol, Washington DC, sección 3.5.
  • Guthie W, Kitui F, Juma es, Obvana DO, Mwai J, Kwamanga d 1993. Estudio comparativo sobre la fiabilidad de la microscopía de fluorescencia y el método Ziehl-Neelsen en el diagnóstico de la tuberculosis pulmonar. East Afri Med J 70: 263-266.
  • Heifets L 1997. Laboratorio de micobacteriología., Clin Chest Med 18: 35-41 .
  • Holst e, Mitchson DA, Radhakrishna s 1959. Examen de frotis para bacilos de tubérculos por microscopía de fluorescencia. Ind J Med Res 47: 495.
  • Janda WM 1997. Micobacterias. In EW Koneman, SD Allen (eds), colour Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 5 ed., JB Lippincott Co., Philadelphia, P. 893-949.
  • Kent PT, Kubica GP 1985. Public Health Mycobacte-riology: A Guide for Level III Laboratory, US Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta, P. 3-10.
  • Lambi EA 1995., Selección e incubación de medios para el aislamiento de micobacterias en micobacteriología. En HD Isenberg, Clinical Microbiology Procedures Handbook, Amer Soc Microbiol, Washington DC, sección 3.6.
  • Lempert H 1944. Microscopía de fluorescencia en los bacilos del tubérculo de detección. Lancet 2: 818.
  • Nagpaul DR 1967. Programa Distrital de control de la tuberculosis en concepto y esquema. Ind J Tubercle 14: 186.
  • Nelson SM, DEIKE MA, Cartwright CP 1998. Valor del examen de múltiples muestras de esputo en el diagnóstico de tuberculosis pulmonar. J Clin Microbiol 36: 467-469., Ozturkeri H, Demir MA, Balli s, Aydilek r 1997. Evaluación comparativa de diferentes métodos de tinción en el diagnóstico de tuberculosis. Bull Microbiol 31: 231-236.
  • Pollock HM, Wieman EJ 1977. El frotis resulta en el diagnóstico de micobacteriosis utilizando microscopía de fluorescencia de luz azul. Clin Microbiol 5: 329-331.
  • Sommers HM, McClatchy JK, Morello JA 1988. Diagnóstico de laboratorio de la micobacteriosis, CUMITECH 16, Amer SoC Microbiol Washington DC, P. 3-8. ,

Table I | Table II