Laboratoire de microbiologie

La tache de gram, développée à l’origine en 1884 par Christian Gram, est probablement la procédure la plus importante de toute la microbiologie. Ce doit être l’une des procédures les plus répétées dans n’importe quel laboratoire. Gram utilisait en fait des colorants sur des cellules humaines et a constaté que les bactéries liaient préférentiellement certains colorants. La tache Gram est une tache différentielle, par opposition à la tache simple qui utilise 1 colorant. À la suite de l’utilisation de 2 colorants, faisant de cette procédure une tache différentielle, les bactéries deviendront violettes/bleues ou roses pendant la procédure.,

avant la coloration, l’échantillon doit être monté et fixé sur les lames, comme cela a été fait précédemment dans la technique de coloration simple. En raison des 2 colorants utilisés dans la procédure–crystal violet et safrinin—ainsi que du décolorant acétone-alcool, les bactéries tomberont en 2 groupes en fonction de leur réactivité en gram. Les bactéries à Gram positif conservent le violet cristallin même à travers l’étape de décolorizor: les bactéries à gram négatif ne retiennent pas le violet cristallin, sont décolorées, puis ramassent le colorant safrinin., Les deux gram + et-se lient au violet cristallin: l’étape clé de leur différenciation est la décoloration.

regardez le schéma ci-joint de la procédure de coloration et ses effets sur la couleur bactérienne. Au cours de l’étape cristalline violet-iode, les molécules liées dans le peptidoglycane de la paroi cellulaire gram + et dans la membrane sont maintenues fermement. L’acétone-alcool provoque en fait le rétrécissement des molécules de peptidoglycane (disposées en treillis), maintenant ainsi le cristal violétiodine encore plus serré., Dans la cellule à gram, la couche de lipopolysaccharide externe de la paroi est dissoute par les agents décolorants, et parce que la couche de peptidoglycane est si mince dans ce groupe de bactéries, le violet cristallin est lessivé hors de la paroi.

bien qu’il existe une routine standard et un ensemble de réactifs utilisés dans cette tache, chaque personne doit trouver une méthode particulière qui lui convient le mieux., Les nombreuses variables qui peuvent affecter cette tache sont l’âge de la culture, la quantité de décolorant utilisée, le moment de la décoloration, le type d’organisme (les bactéries et les spores acides ne tachent pas bien), l’épaisseur du frottis et le soin général du colorant.

Les raisons les plus courantes des réactions de faux gram?

• certaines espèces bactériennes tendent vers la variable gram, et montreront les deux couleurs bien que le plus souvent gram +.
• sur décolorer le frottis, un temps trop long.
• utiliser des cultures anciennes (de préférence, les cultures doivent avoir entre 18 et 48 heures).,

la procédure: fait individuellement

1. nous avons des cultures D’E. coli et de Bacille pour que vous puissiez les colorer. Cela vous donnera des contrôles gram + et gram – pour vérifier votre procédure., Vous pouvez utiliser 2 diapositives, 1 pour chaque bactérie, ou vous pouvez diviser une diapositive en deux et enduire chaque bactérie sur la diapositive divisée. Il existe également des lames préparées et colorées de bactéries de différentes formes et tailles de bactéries à regarder.
2. faire le frottis bactérien à partir de bouillon, oblique ou plaque.
   • si pris dans un bouillon, utiliser 1-2 boucles de la solution de bouillon.
   • s’il est prélevé dans un milieu de gélose solide (plaque ou oblique), suspendre l’inoculum dans une goutte d’eau sur la lame et bien mélanger.,
   • étaler la suspension sur la glissière de sorte qu’elle recouvre une surface au moins de la taille d’un nickel, de préférence un quart.
   • vous pourriez penser à marquer la zone de frottis avec une marque de crayon de cire environnante afin que vous puissiez trouver le frottis au microscope facilement.
   • placez un morceau de ruban adhésif sur le côté du frottis afin de savoir dans quelle direction se trouve le frottis.
3. Laissez-le glisser sécher à l’air complètement avant de poursuivre la procédure.
4. chaleur-fixez la lame en la tenant à une extrémité avec vos doigts et en la déplaçant rapidement d’avant en arrière plusieurs fois sur la flamme.,
5. effectuez la procédure de coloration comme indiqué ci-dessous.

procédure de coloration

• placez la lame sur le revêtement en treillis métallique de la cuve de teinture.
• Inonder le frottis avec des gouttes de cristal violet, laissant pendant 1 minute. Bien laver avec de l’eau.
• inonder le frottis avec des gouttes d’iode de Gram, en laissant pendant 1 minute. Bien laver avec de l’eau.
• inonder l’Acétone-Alcool rapidement sur la lame, et laver dans les 5-10 secondes (à partir du début du décolorant ajouté). Bien laver avec de l’eau.
• inondez le frottis avec des gouttes de safrinine, en laissant agir pendant 1 minute., Bien laver avec de l’eau.
• éponger avec du papier bibulous avant de placer sur la scène du microscope pour voir.

1. concentrez-vous sur le frottis à l’aide d’une lentille de faible puissance, se terminant par une immersion dans l’huile 100X. Assurez-vous que vous avez une goutte d’huile sur la diapositive avant de faire pivoter votre objectif 100x en place.
2. interprétez les résultats en utilisant le protocole ci-dessous.

Interprétation

• des bactéries à Gram positif sera bleu/ violet/ violet
• des bactéries Gram négatif sera rose clair

1. Identifier les différentes formes et modalités de bactéries.,
2. nettoyez vos diapositives à l’aide du nettoyant pour diapositives au niveau des éviers.
3. Regardez les lames préparées de diverses bactéries. Vous verrez différentes formes et arrangements. Retournez les diapositives préparées sur les plateaux sur le banc.

Diverses bactéries diapositives